Les cupredoxines són proteïnes que s’uneixen a coure a través d’un plegament típic de barril beta en clau grega. El centre de coure T1 coordinat amb quatre lligands del polipèptid plegat permet que les cupredoxines funcionin com a transportadors d’electrons. Giuliano Sciara i Marianne Ilbert, del Laboratori de Bioenergètica i Enginyeria de Proteïnes de l’Institut Mediterrani de Microbiologia de Marselha, són els autors corresponsals d’un article publicat aquesta setmana a la revista Dalton Transactions, amb Magali Roger com a primera autora, en el que mostren una cupredoxina, AcoP, que va més enllà del model de distorsió acoblada. Això indica la diversitat de les cupredoxines pel que fa als lligands d’unió a coure, la geometria del centre de coure, el potencial redox i la funció biològica. AcoP és una cupredoxina periplàsmica de la cadena respiratòria de ferro del bacteri acidofílic Acidithiobacillus ferrooxidans. AcoP és altament resistent a l’acidesa i el seu centre de coure de tipus verd té un potencial redox alt. Roger et al. han caracteritzat estructuralment i biofísica l’AcoP salvatge i dos mutants de lligand de coure (H166A i M171A). L’estructura cristal·logràfica d’AcoP a una resolució de 0,165 nm mostra un plegament típic de cupredoxina. No obstant AcoP disposa de llaços de gran extensió. A més la difracció per raigs X i l’absorció de raigs X (EXAFS) indica que el centre metàl·lic d’AcoP té una combinació de característiques T1 i T1.5. El centre actiu d’AcoP és relativament rígid degut a la presència d’una extensa xarxa de ponts d’hidrogen.
Roger et al. han fet una anàlisi estructural del domini únic de la cupredoxina AcoP
Les cupredoxines
Les cupredoxines són una família de proteïnes d’unió a coure que trobem en tots els regnes biològics. Les trobem com a components claus de processos fisiològics com la respiració, la fotosíntesi, el cicle de nitrogen o l’homeostasi de coure. Tenen en comú un plegament típic amb un sandwich beta integrat per 7-8 cadenes disposades en un barril beta de clau grega. Hom pot diferenciar segons la disposició de les cadenes beta N-terminals entre un plegament com el de la plastocianina o un plegament com els de la rusticianina o l’estel·lacianina.
El plegament típic de la cupredoxina es pot trobar en proteïnes de domini únic, com ara les cuproproteïnes de tipus 1 (azurina, plastocianina, rusticianina), o en proteïnes més complexes (CupA, CopC, PmoD, laccases, bilirubin-oxidases, citocrom c oxidasa, algunes nitrit-reductases). Aquest plegament funciona com un centre de coure que, segons la seva tipologia, actua en la transferència de ions de coure, en el segrest d’àtoms de coure o com a centre catalític.
Les cuproproteïnes T1 són cupredoxines de domini únic que s’uneixen a un únic àtom de coure. Típicament aquest àtom de coure es coordina a través de tres lligands equatorials forts (una cisteïna i dues histidines) i d’un quart lligand axial feble (habitualment, una metionina). Hi ha una heterogeneïtat en la geometria d’aquests centres de coure que es tradueix macroscòpicament en la coloració de la cuproproteïna pura, que pot anar d’un blau clar a un vermell passant per una gama de verds. Així les cuproproteïnes T1 es poden dividir en blaves (T1 clàssiques o tetrahèdriques), verdes (T1.5, amb una geometria tetragonal distorsionada) o vermells (T2, tetragonals).
El model de distorsió acoblada postula que els centres blaus de coure T1 tenen una geometria tetrahèdrica com a resultat d’una longitud curta (0,21 nm) de l’enllaç Cu2+-S(Cys) i d’una longitud llarga (0,3 nm) de l’enllaç Cu2+-S(Met). D’això resulta una transició de transferència de càrrega del lligand al metall que es manifesta en una banda forta d’absorció a una longitud d’ona de 600 nm.
En els centres verds T1.5 la banda d’absorció a 600 nm és més feble, i s’acompanya d’una banda addicional a 450 nm. En el cas de la rusticianina, de l’estel·lacianina i de la proteïna bàsica del cogombre, els centres de coure són a mig camí entre T1 i T1.5. La nitrosocianina presenta un centre vermell T2.
El potencial redox de les cuproproteïnes T1 va de +90 mV (auracianina D) a +680 mV (rusticianina).
El grup de recerca de Sciara i Ilbert descobrí i caracteritzà una cupredoxina com a proteïna associada a la citocrom c oxidasa d’Acidithiobacillus ferrooxidans. Designada com a AcoP, aquesta és una proteïna associada a membrana que consta d’un domini d’unió a coure localitzat en la cara periplàsmica i d’una àncora que s’endinsa en la membrana cel·lular a través d’un segment transmembrana que ocupa la posició N-terminal de la proteïna. AcoP interactua amb l’enzim terminal de la cadena respiratòria, la citocrom c oxidasa. AcoP contribueix a mantindre l’activitat citocrom c oxidasa sota les condicions extremadament àcides del periplasma (pH 3). AcoP també participaria en la transferència d’electrons que permet a A. ferrooxidans de fer un metabolisme quimiotròfic basat en l’oxidació de ferro.
El potencial redox d’AcoP és de +566 mV a un pH de 5.
Roger et al. han aplicat sobre l’AcoP tècniques de cristal·lografia de raigs X, SAXS i EXAFS. Han obtingut espectres d’absorció de llum ultraviolada i visible de proteïnes AcoP purificades amb un espectrofotòmetre Cary 50 Bio de Varian.
Els cristalls d’AcoP i dels mutants M171A i H166A foren obtinguts amb una tècnica de difusió de vapor. El potencial redox de M171A és tan alt que els cristalls romanien amb una tonalitat verda transparent al cap d’un any i sense que fos possible reduir-los.
Les dades de difracció de raigs X foren recollides en els sincrotrons ESRF (de Grenoblo) i de Soleil (a Gif-sur-Yvette).
Les dades d’estructura fina per absorció de raigs X (EXAFS) i d’estructura de vores per absorció de raigs X (XANES) es recolliren de la Font de Llum del Sincrotró de Stanford.
Les dades de dispersió de raigs X d’angle petit (SAXS) es recolliren a la Font de Llum Avançada del Lawrence Berkeley National Lab.
L’estructura d’AcoP
Els cristalls nadius d’AcoP són incolors, cosa que indica que en condicions aeròbiques es troben en la forma reduïda, cosa atribuïble al seu elevat potencial de reducció. L’estructura de raigs X revela una unitat asimètrica integrada per dues molècules (A i B). Aquests dos polipèptids no mostren gaire interacció, de manera que cal pensar, com corroborarien les dades de SAXS, que en solució la proteïna AcoP seria monomèrica. Amb un exponent de Porod de 4.0, cal pensar que en solució AcoP és una proteïna globular plegada. Les dades de SAXS indiquen una massa molecular de 13 ± 5 kDa, amb una dimensió per la part més ample de 5,3 nm.
AcoP presenta la topologia típica de les cupredoxines de barril beta en clau grega de la subfamília de la rusticianina. No obstant s’hi observa un llaç d’hèlix alfa de 6 residus que connecta els tres lligands de coure entre la histidina C-terminal i els lligands de cisteïna. També és particularment llarg el llaç β6–β7. Així doncs a AcoP trobem una regió divergent entre les posicions 90 i 128. Aquesta regió divergent es repeteix en les bases de dades de cuproproteïnes de bacteris acidofílics.
L’estructura dels cristalls d’AcoP confirma la identitat dels residus lligands de coure que havien assenyalat els estudis bioinformàtics i de mutagènesi. És la primera vegada que es caracteritza estructuralment amb aquest nivell d’un domini únic de cupredoxina de tipus verd. Les distàncies entre l’àtom de Cu i els lligands d’histidina són les típiques dels centre de coure T1, com també ho és la distància Cu-S(Cys). En canvi, la distància Cu-Met171 és més semblant als centres de coure T1.5.
Roger et al. posen de manifest que la teoria de distorsió acoblada no reflecteix ni les distàncies ni els angles del centre de coure d’AcoP. Han obtingut dades tant de la forma oxidada com de la forma reduïda d’AcoP.
Pel que fa a les mutacions H166A i M171A, que afecten a lligands de coure, Roger et al. o detecten canvis ni en el plegament de la proteïna ni en la capacitat d’unió a coure. Sí que s’alteren notablement les propietats espectroscòpiques i el potencial redox. L’AcoP H166A (on l’histidina-166 és substituïda per alanina) actua com una proteïna d’unió a Cu+. L’AcoP M171A (on la metionina-171 és substituïda per alanina) actua com una proteïna d’unió a Cu2+ de color vermell.
La diversitat entre les cupredoxines.
Roger et al. creuen necessari realitzar anàlisis in vitro i in cristallo d’altres cupredoxines. De particular interès seria esclarir el rol dels llaços alfa de les cupredoxines de bacteris acidofílics. Sembla possible que en el cas de l’AcoP confereix un rol protector sobre CoxB, la subunitat II de la citocrom c oxidasa de A. ferrooxidans.
Roger et al. remarquen la rigidesa del centre de coure verd d’AcoP, atribuïble a la bastida polipeptídica. Aquesta rigidesa és important per mantenir l’estructura davant dels canvis d’oxidació de l’àtom de coure, aspecte essencial per a la funció de transferència en una cadena d’electrons.
Lligams:
– Beyond the coupled distortion model: structural analysis of the single domain cupredoxin AcoP, a green mononuclear copper centre with original features. Magali Roger, Philippe Leone, Ninian J. Blackburn, Sam Horrell, Tadeo Moreno Chicano, Frédéric Biaso, Marie-Thérèse Giudici-Orticoni, Luciano A. Abriata, Greg L. Hura, Michael A. Hough, Giuliano Sciara, Marianne Ilbert. Dalton Trans. (2024).
Des de la Mediterrània 