Maria Teresa Arias-Moliz, professora titular de microbiologia de la Universidad de Granada i membre del Instituto de Investigación Biosanitaria de Granada, és la primera autora i autora corresponsal d’un article que apareix avui al International Endodontic Journal en el que s’analitza i compara el microbioma present en canals radiculars i en lesions periapicals de dents amb infeccions posteriors a un tractament odontològic. Arias-Moliz et al. volen identificar amb aquesta anàlisi tàxons claus en aquests hàbitats, consistents en àpexs i lesions periapicals extretes quirúrgicament de pacients de periodontitis apical posterior a un tractament. Els espècimens eren criopulveritzats per fer-hi una extracció d’ADN bacterià. Dels extractes d’ADN s’obtenien seqüències amb la plataforma Illumina Miseq de les regions hipervariables V3-V4 del gen ARNr 16S. Amb el programari Mothur les seqüències eren classificades en unitats taxonòmiques operatives (OTUs). Els índexs de diversitat resultants eren comparats amb un test de Kruskal-Wallis, i les diferències en composició de les comunitats bacterianes eren analitzades per anàlisi de variància multivariat permutacional (PERMANOVA). L’anàlisi PICRUSt oferia un estudi funcional bacterià i amb SparCC s’obtenien xarxes de co-presència. Un tàxon cabdal és aquell que ocupa un lloc central i es present de manera general amb abundància. Arias-Moliz han analitzat trenta-dos àpex i trenta-nou lesions periapicals. Teixits sans i teixits lesionats mostren una composició semblant. Les espècies bacterianes més abundants són Fusobacterium nucleatum, Prevotella loescheii, Streptococcus intermedius, Porphyromonas gingivalis, Parvimonas micra, Synergistetes bacterium, Tannerella forsythia i Peptostreptococcus stomatis. Funcionalment les vies metabòliques més representades genòmicament són les relacionades amb el transport de membrana, processament de la informació genètica i metabolisme. L’únic tàxon que ocupa un lloc cabdal en aquestes mostres és F. nucleatum.
L’anàlisi de correlació i copresència SparCC dels tàxons bacterians presents en lesions endodòntiques post-tractament mostra que ‘Fusobacterium nucleatum’ ocupa un lloc clau
La periodontitis apical post-tractament
La periodontitis apical post-tractament és una resposta inflamatòria dels teixits apicals degut a la presència de microorganismes en el terç apical del canal radicular. El tractament previ del canal radicular no hauria eliminat alguns d’aquests microorganismes o potser n’hauria introduït de nous. Un altre origen possible d’aquests microorganismes és una fuita procedent de la corona de la dent. A més dels microorganismes radiculars, d’altres d’externs poden contribuir a la malaltia periapical. En algunes lesions no es detecta la presència de microorganismes, possiblement per haver estat eliminats per cèl·lules del sistema immunitari.
Esquema d’una dent. Els canals radiculars són assenyalats amb els números 24 i 25. L’extrem apical de l’arrel és la part més fonda de la dent.
Les infeccions endodòntiques persistents tenen un caràcter polimicrobià, i amb una considerable variabilitat interindividual sobre les espècies microbianes implicades. Hom diu que tota una sèrie d’espècies bacterianes són funcionament redundants en el sentit que acaben per generar infeccions similars. Bacteris amb capacitat d’envair l’interior de cèl·lules de l’hoste o de proteolitzar els teixits, com ara Porphyromonas i Fusobacterium, són habituals en les infeccions persistents. També és habitual trobar-hi bacteris amb flagel que, a més d’afavorir la motilitat bacteriana, desencadenen una resposta immunitària a través de l’activació del receptor Toll-like.
Hom considera, doncs, que l’agent causal d’aquestes infeccions és una comunitat microbiana complexa. Ara bé, no tots els membres d’aquesta comunitat tenen la mateixa rellevància. Alguns membres tindrien una importància cabdal en la patogenicitat, com és el cas de Porphyromonas gingivalis en la periodontitis: aquest bacteri destrueix teixit i els exudats rics en nutrients que allibera aquest procés desencadenen el creixement d’altres bacteris patògens.
Per a identificar espècies cabdals en l’endodontitis, Arias-Moliz et al. comparen el microbioma dels canals radiculars amb el microbioma de lesions periapicals d’infeccions secundàries (és a dir, post-tractament).
Un estudi observacional de mostres recollides entre el juliol del 2019 i el setembre del 2022
Maria Teresa Arias-Moliz prengué part en la concepció d’aquest estudi, en la feina de laboratori, i en la redacció, revisió i edició de l’article. Virginia Perez-Carrasco, de GENYO i de la Unitat de Microbiologia del Hospital Universitario Virgen de las Nieves, processà les mostres, realitzà les anàlisis bioinformàtiques i contribució a la redacció de l’article. David Uros-Torrez, de Granada, recollí les mostres. Jose Santana Ramos (Dept. Microbiol. Univ. Granada) processà les mostres i realitzà l’anàlisi bioinformàtica. Miguel Soriano i Jose Antonio García-Salcedo (GENYO) prengueren part en la concepció de l’estudi i en la revisió de l’article. Els autors agraeixen a Francisca Castillo Pérez l’ajut tècnic. L’estudi s’ha finançat amb programes de la Junta de Andalucía, del Ministerio de Ciencia e Innovación, i de la Universidad de Almería.
Arias-Moliz et al. segueixen les línies STROBE d’enfortiment del report d’estudis observacionals. L’estudi comptà amb l’aprovació, en el 2017, del Comitè Ètic de la Universitat de Granada. Les mostres foren recollides per un endodontista en una consulta privada entre el juliol del 2019 i el setembre del 2022. Tots els pacients signaven prèviament un consentiment informat per a ésser inclosos en l’estudi.
Eren criteris d’inclusió en l’estudi que els pacients mostressin evidència radiogràfica de periodontitis apical persistent. Eren exclosos els pacients amb malalties sistèmiques severes, les dones gestants o lactants, i els menors d’edat. També eren excloses les dents amb butxaques periodontals de més de 4 mm, o les que tenien una fractura d’arrel vertical, o bé un historial de trauma.
Les mostres s’extreien en condicions estrictament asèptiques. Els pacients s’esbandien la boca amb una solució de clorhexidina durant 30 segons, i el lloc d’intervenció quirúrgica era fregat amb una gasa mullada en clorhexidina. Les lesions i els àpexs eren exposats i seccionats amb ultrasons. Ja extreta lesions i àpexs eren separats amb pinces i introduïts en tubs Eppendorf amb un tampó Tris-EDTA. Els tubs eren conservats a -20°C. Les mostres eren posteriorment polvoritzades amb un morter sota nitrogen líquid.
En l’estudi s’inclouen 98 mostres (47 àpexs i 51 lesions). L’extracció d’ADN es feia després d’una preincubació amb lisozima. La qualitat d’ADN s’avaluava amb controls negatius i per espectrofometria. L’amplificació per PCR es feia amb els encebadors 340F (Illumina adaptors + 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) i 800R (Illumina adaptors + 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′). Els productes d’amplificació eren seqüenciats amb la plataforma Illumina MiSeq.
Les seqüències eren analitzades i filtrades amb el programari Mothur. S’avaluava la diversitat taxonòmica de cada mostra, i l’abundància de cada tàxon. Amb PICRUSt s’inferia la funcionalitat de cada tàxon. Les comunitats bacterianes eren comparades amb una anàlisi de components principals.
Més d’un milió de lectures
Arias-Moliz et al. han obtingut 1.164.873 lectures. Les mostres d’àpexs generen de mitjana 20.000 lectures, i les de lesions periapicals 10.000. De les 98 mostres, 15 d’àpexs i 12 de lesions periapicals foren excloses per manca d’amplificacions. Així, l’anàlisi ulterior es basa en 32 mostres d’àpexs i 39 mostres de lesions periapicals.
La diversitat alfa de seqüències és similar en àpexs i lesions periapicals, tant si es mesura en riquesa d’espècies com en índexs Chao1, Simpson, Shannon o Pielou. Tampoc no hi ha diferències en la composició de comunitats, d’acord amb l’anàlisi de components principals, ni tampoc per PERMANOVA.
En total en les mostres s’han detectat 11.963 unitats taxonòmiques operatives (OTUs), de les quals 222 són prou abundants (>0,01%) com per entrar en l’anàlisi ulterior. Amb diferència la més dominant i abundant és Fusobacterium nucleatum.
Atenent a les OTUs detectades, les vies metabòliques més presents en les mostres deuen ser vies de transport de membrana (transportadors, sistemes de secreció), vies de processament de la informació genètica (sistemes de traducció a proteïna, transcripció a ARN, replicació i reparació d’ADN) i de metabolisme (aminoàcids, carbohidrats, energia, nucleòtids, cofactors, vitamines).
Tan sols F. nucleatum compleix els tres criteris d’espècie cabdal: és present a totes les mostres, és central en la majoria i és abundant.
El rol de Fusobacterium nucleatum en infeccions secundàries de canals radiculars
Una espècie cabdal en una comunitat microbiana determina les interaccions entre les altres espècies, i l’evolució en el temps i l’adaptabilitat d’aquesta comunitat.
En les infeccions endodòntiques secundàries no es produeix una alteració significativa de la comunitat microbiana ja existent en els canals radiculars. Això podria explicar-se pel fet que el foramen apical posa en contacte tots dos espais. Les comunitats microbianes de dins i de fora de la lesió són d’un metabolisme anaerobi, que té com a font nutricional proteïnes i glicoproteïnes del sèrum periapical inflamatori. En aquest consorci degradador de sèrum trobem una barreja de microorganismes de creixement lent i de microorganismes de creixement ràpid. Hi ha, doncs, microorganismes sacarolítics (S. intermedius i P. loescheii), però també de proteolítics (F. nucleatum, P. gingivalis, P. micra, T. forsythia i P. stomatis). Entre els factors patogènics d’aquesta microbiota periodontal destaquen l’activitat proteolítica, la capacitat d’invasió de cèl·lules humanes, la inducció de resposta immunitària i de promoció de citocines proinflamatòries, o la formació de càpsules de protecció.
La presència de Pseudomonas lactis en una abundància relativament alta podria ser originada per introduccions durant el tractament previ del canal radicular.
F. nucleatum té una capacitat de coagregació gràcies a adhesines (Fap2, RadD i aid1). Així podria constituir un pont entre els colonitzadors primaris (Streptococcus) i els colonitzadors anaerobis secundaris (Tannerella i Porphyromonas). Entre els primers colonitzadors, F. nucleatum afavoreix per proteòlisi la disponibilitat d’aminoàcids i poliamides. Amb altres bacteris orals, F. nucleatum té un comportament sinergístic que afavoreix la pèrdua d’os, la formació d’abscessos i la mort de cèl·lules humanes. A través de l’adhesió amb FadA, F. nucleatum pot envair cèl·lules endotelials i facilitar una major permeabilitat de l’endoteli vascular. F. nucleatum fomenta l’apoptosi de limfòcits, la producció de citocines inflamatòries, la necrosi de neutròfils, etc. La inflamació pot acabar fornint més nutrients a aquests bacteris. No obstant, algunes de les mostres d’Arias-Moliz et al. ja no presenten nivells detectables d’ADN bacterià, de manera que la inflamació pot arribar a guanyar-los la partida.
Arias-Moliz et al. consideren necessari ampliar el nombre de mostres de l’estudi, així com incloure les d’altres localitats. A més la metagenòmica s’hauria de completar amb altres òmiques (metatranscriptòmica i metaproteòmica). També convindria conèixer l’impacte d’antibiòtics clínics sobre aquestes comunitats bacterianes.
Lligams:
– Identification of keystone taxa in root canals and periapical lesions of post-treatment endodontic infections: Next generation microbiome research. Maria Teresa Arias-Moliz, Virginia Pérez-Carrasco, David Uroz-Torres, Jose Domingo Santana Ramos, Jose Antonio García-Salcedo, Miguel Soriano. Int. Endod. J. (2024).
Des de la Mediterrània 