En temps de la genòmica clàssica, en les darreries del segle XX, es difongué l’acrònim ORF (open reading frame, pauta oberta de lectura) com a sinònim pràctic de fragments del genoma que eren traduïts en seqüència proteica. Un ORF es caracteritza per un seguit de seqüències consens que guien la maquinària de transcripció (d’ADN a ARN) i de traducció (d’ARN a proteïna). Més enllà dels ORFs canònics n’hi ha de no-canònics, en el sentit que també són pautes obertes de lectura, però que segueixen una mecànica diferent. Alguns ORFs no-canònics (ncORFs) codifiquen seqüències peptídiques breus, anomenades microproteïnes. En els grans projectes òmics ncORFs i microproteïnes solen ser passades per alt, però hi ha grups de recerca com els de Puri Fortes, Júlia Perera-Bel o M. Mar Albà, que volen posar-hi remei. En el marc del treball doctoral de Marta Espinosa Camarena, han investigat si aquestes microproteïnes són rellevant en el perfil antigènic específic de tumors hepàtics. El perfil antigènic específic d’un tumor és crucial per a la resposta que hi faci el sistema immunitari, i pot oferir claus per al desenvolupament d’estratègies terapèutiques. En un article a Science Advances, Camarena et al. expliquen com han analitzat dades de seqüenciació d’ARN de 177 casos de carcinomes hepatocel·lulars, bo i comparant-les amb les de teixit hepàtic normal. Ho han combinat amb dades de perfil ribosòmic i immunopeptidòmic. El pas següent era fer prediccions d’unió entre els antígens/epítops específic de tumor i leucòcits humans, i seguidament validar-lles experimentalment. Així estimen que vora un 40% dels antígens específics de tumor de carcinoma hepatocel·lular corresponen a pèptids derivats de ncORFs. Entre aquests pèptids han trobat dos que són capaços de provocar resposta immunitària en un model humanitzat de ratolí. Camarena et al. han identificat un subconjunt de 33 ARNs llargs no-codificants específics de tumor que expressarien antígens cancerosos cadascun d’ells presents en més del 10% de les mostres tumorals analitzades: combinats cobririen una gran proporció de pacients de cara a desenvolupar vaccins anticancerosos.
Camarena et al. han constatat en un metatranscriptoma de càncer hepatocel·lular humà, que vora un 40% dels antígens específics de tumor deriven de gens no-canònics
Antígens específics de tumor
Marta E. Camarena compilà les mostres i realitzà la majoria d’anàlisis computacionals. Patrick Theunissen (CIMA Pamplona), Marta Ruiz (CIMA), Carla Castro (CIMA), Puri Fortes i Pablo Sarobe (CIMA) realitzen experiments in vitro d’unió HLA-pèptid, i estudis d’immunització en ratolins. Jorge Ruiz-Orera (Max Delbrück Center, Berlin) analitza dades de Ribo-Seq. Beatriz Calvo-Serra (UPF) i Robert Castelo (UPF) analitzar la superposició de lncRNAs expressats per tumors amb elements transposables del genoma. Camarena, Ruiz-Orera, Sarobe, Perera-Bel i Albà contribuïren a la concepció de l’estudi i al disseny d’experiments. Fortes, Perera-Bel i Albà supervisaren l’estudi. Camarena i Albà redactaren l’article amb aportacions dels altres autors.
La recerca es finançà amb projectes del Ministeri de Ciència i Investigació, de la Unió Europea, del Gobierno de Navarra i de la Generalitat de Catalunya.
Els autors agraeixen a J. C. Montañés i C. Papadopoulos l’ajut en l’anàlisi de Ribo-Seq i d’immunopeptidòmica, a D. Llopiz per l’ajut en experiments de citometria de flux. El treball és dedicat a la co-autora Beatriz Calvo-Serra, que es va morir a 27 anys el passat 10 de gener.
En el desenvolupament d’immunoteràpia contra el càncer hom cerca candidats a constituir inhibidors de control immune o de vaccins. La base fisiològica d’aquesta immunoteràpia és la capacitat del sistema immunitari de reconèixer com a «antígens», és a dir com a estructures alienes, molècules unides a HLA (l’acrònim anglès d’antígens leucocitaris humans). La transformació tumoral comporta, en efecte, la generació de neoepítops, és a dir de molècules de superfície prou diferents a aquelles que ha après a tolerar el sistema immunitari com a pròpies. Els neoepítops poden resultar de mutacions no-sinònimes del genoma tumoral. També poden sorgir de canvis substancials en l’expressió gènica de les cèl·lules tumorals. En el cas de melanomes, càncer de pulmó o càncer de bufeta, caracteritzats per l’acumulació de nombroses mutacions, els epítops específics de tumor responen en bona part a aquestes mateixes mutacions. Com major és la càrrega mutacional d’un tumor, i la fracció de pèptids mutats amb afinitat amb molècules HLA, major seria l’actuació del sistema immunitari sobre el tumor.
El carcinoma hepatocel·lular, que suposa el 90% dels casos de càncer hepàtic, té una taxa de mutació acumulada relativament reduïda. La major part d’antígens específics d’aquest tipus de tumor són el resultat de l’alteració en l’expressió cel·lular. Seria el cas dels CTAs o de pèptids derivats de retrovirus endògens humans (HERVs). En són exemple MAGE1A o NY-ESO, utilitzats com a base de vaccins antitumorals, però que abastarien tan sols una fracció petita de tumors. Camarena et al. sostenen que cal augmentar la llista de dianes adients que combinin una alta especificitat de tumor amb una presència en el major nombre de pacients. I pensen precisament en els productes peptídics derivats de la traducció de ncORFs.
Els ncORFs reben l’acrònim de nc, de non-coding, no-codificants, perquè no són anotats clàssicament com a codificadors de proteïna. Però sí que són codificadors, de manera que la nc l’hem de reinterpretar com a no-canònics. Els pèptids MELOE-1 i MELOE-2 són codificats per meloe, un ARN llarg no-canònic que prèviament s’havia considerat no codificant. El nom de meloe fa referència al fet d’haver estat descobert en melanomes: MELOE-1 i MELOE-2 són sobreexpressats en melanomes, i desencadenen una resposta de limfòcit T reactiu. Els ARN llarg no-canònics (no-codificants) tenen l’acrònim anglès lncRNAs. Aquests lncRNAs són transcrits de ncORFs. Han estat objecte d’una recerca intensa en els darrers anys i se n’han identificat milers. Els lncRNAs són traduïts al seu torn en seqüències peptídiques curtes o microproteïnes.
L’espectrometria de masses ha permès el desenvolupament de la immunopeptidòmica, és a dir en l’estudi agregat de pèptids presentats al sistema immunitari. Així hom ha constatat en línies cel·lulars tumorals i en tumors la presència de pèptids derivats de ncORFs que són presentats en molècules HLA.
Si un ncORFs és expressat alhora per cèl·lules sanes i cèl·lules tumorals, els pèptids que en resultin, en ser presentats en HLA, produiran una resposta tolerogènica més que no pas immunogènica. Així l’interès és en aquells ncORFs que són expressats específicament en línies tumorals.
Transcrits específics de carcinoma hepatocel·lular
Camarena et al. han seleccionat quatre cohorts pacients amb carcinoma hepatocel·lulars pels quals hi ha dades transcriptòmiques tant per al tumor com a teixit hepàtic adjacent normal. Les quatres plegades representen 117 paciets.
Camarena et al. també han seleccionat dades de seqüenciació de perfil ribosòmic (Ribo-Seq) de 10 carcinomes hepatocel·lulars.
Per a la validació Camarena et al. fan servir tres biomarcadors de carcinoma hepatocel·lular:
– sobreexpressió del gen TERT.
– sobreexpressió del gen THBS4.
– infraexpressió del gen MT1M.
Aquests biomarcadors són reproduïts en la comparació de teixit normal i teixit tumoral en les cohorts estudiades.
El pas següent era quantificar-hi l’expressió gènica, descobrir-hi transcrits prèviament desconeguts i identificar-hi transcrits que fossin específics de tumor. Les dades de Ribo-Seq orientaven la predicció de la traducció de ncORFs. La informació específica de HLA de pacients de la metacohort ajudava predir la unió de pèptids derivats de ncORFs en HLA-I.
Les prediccions eren després validades en assaigs in vitro d’unió HLA-pèptid. Després ho eren en experiments d’immunogenicitat en ratolins que expressen la molècula HLA humana.
Les dades de RNA-Seq de la metacohort indiquen que els lncRNAs i els transcrits prèviament desconeguts tenen un nivell d’expressió inferior als gens canònics («gens codificadors de proteïnes»). Això és força esperable i Camarena et al. introdueixen un tall per acceptar únicament els transcrits que presenten més de 1 fragment per cada milió de kilobases.
També és esperable un altre resultat que troben Camarena et al.: els lncRNAs i els nous transcrits tenen un nombre d’introns inferior al dels gens canònics. Molts dels nous transcrits, tot i no aparèixer anotats en Ensembl, sí que apareixen en miTranscriptome, una base de dades que conté transcrits de tumors.
Cada mostra de tumor de la metacohort expressa entre 10.000 i 20.000 gens canònics, mentre que el nombre de transcrits no-canònics va de 2.000 a 4.000. L’expressió de transcrits no-canònics varia més de pacient a pacient que la de transcrits canònics.
La traducció de lncRNAs en tumors
Els transcrits no-canònics identificats en les cohorts HCC1, HCC3 i TCGA han estat examinats en la cohort HCC4 per predir-ne el nivell de traducció. La traducció d’un ARN depèn d’entrada d’un codó d’inici. Camarena et al. consideren com a putatius codons d’inici ATG, ACG, CTG i TTG. Apliquen el programa RibORF v1.0 a aquestes seqüències. Així troben un total de 251 lncRNAs traduïbles, dels quals 124 són presents en totes les cohorts.
El nombre de ncORFs que són traduïts en la metacohort puja a 909, dels quals 524 són comuns a totes les cohorts. La majoria dels transcrits contenen seqüències múltiples de ncORFs. Les proteïnes resultants són més petites que les proteïnes canòniques. Els codons d’inici més habituals són ATG i CTG.
L’índex de traducció predit per als lncRNAs de la metacohort és de 0,116. Els transcrits nous tenen un índex inferior, de 0,0053.
ZNF674 és un gen canònic. Ara bé dins de la seva seqüència trobem una ncORF, ZNF674-AS1, que es transcriu en sentit contrari al transcrit canònic. ZNF674-AS1 utilitza un promotor bidireccional. Una baixa expressió de ZNF674-AS1 en tumors s’associa a un mal pronòstic.
LINC01419 és un lncRNA que es transcriu i es tradueix en tumors de la metacohort, però no en teixit sa adjacent.
lncRNAs específics de tumor
Camarena et al. identifiquen els lncRNAs específics de tumor de la metacohort comparant amb les dades de teixit sa, amb les taules GTEx i amb transcriptomes d’òrgans sans.
En fer aquest triatge sobre tots els transcrits, Camarena et al. detecten un enriquiment de la fracció de lncRNAs i de transcrits nous.
Val a dir, que entre un 23 i un 40% dels lncRNAs específics de tumor en la metacohort s’expressen també en testicles. Això recorda la vella analogia que es fa entre cèl·lules tumorals i cèl·lules germinals.
Els lncRNAs són enriquits en regions del genoma ocupades per elements transposables. Camarena et al. troben que els lncRNAs específics de tumor tenen un enriquiment addicional en HERVs. Paga la pena recordar que en processos cancerosos hi ha una tendència a l’activació d’HERVs. És possible que la desmetilació de regions que contenen HERVs que trobem en la transformació tumoral tingui quelcom a veure amb una sobreexpressió en tumors de part dels lncRNAs.
Antígens específics de tumor
Camarena et al. utilitzen NetMHCpan per predir tots els nonapèptids amb forta afinitat d’unió a HLA-I (IC50 < 50 nM) d’entre tots els transcrits específics de tumor de la metacohort i dels pèptids que contenen mutacions somàtiques. Les dades transcriptòmiques permeten afinar aquesta relació utilitzant el tipus específic d’HLA de cada pacient de la metacohort.
Camarena et al. es fixen especialment en pèptids que no es trobin en teixits normals. Amb aquest filtratge enumeren una sèrie de pèptids de lncRNAs i de gens canònics: el 49% són gens canònics, el 39% són lncRNAs, el 7% són altres transcrits nous i el 5% són mutacions.
La unió in vitro a HLA de 13 pèptids derivats de ncORF
Camarena et al. han assajat en un model in vitro, concretament de cèl·lules T2 HLA-A*02:01+, l’afinitat de 13 pèptids derivats de ncORFs per unir-se establement a HLA-A*02:01, un exemple de molècula HLA de classe I. D’aquests 13 pèptids 5 es corresponen als lncRNAs específics de tumor que comparteixen més d’un 22% dels pacients de la metacohort; 5 de lncRNAs específics de tumor menys freqüents; i 3 de ncORFs amb una alta afinitat a HLA segons la predicció molecular. Dels 13 pèptids, 9 presenten afinitats in vitro comparables amb la predicció molecular.
Quatre pèptids foren injectats en ratolins HDD-DR1
Els ratolins HDD-DR1 expressen molècules HLA humanes, concretament HLA-A*02:01 i HLA-DRB1*01. Camarena et al. han injectat quatre dels 13 pèptids abans esmentats en aquests ratolins. Al cap de 14 dies d’una segona infecció mesuraven els nivells d’interferó-γ. Aquests nivells d’interferó pujaven fortament en els ratolins als que s’havia administrat el pèptid WMSLDWELYV (AC079466.1) o el pèptid GLFHIYHKI (AC098820.3). Com a control comprovaren que cap d’aquests pèptids indueix resposta en esplenòcits de ratolins no-immunitzats amb ells. Les respostes als pèptids serien mitjançades per cèl·lules T CD8+.
L’expressió de lncRNAs específics de tumor en diferents grups de pacients
Els transcrits específics de tumor que comparteixen més d’un 10% dels pacients de la metacohort i que són expressats en un nivell superior a 5 fragments per kilobase per milió de lectures mapades en almenys una mostra es corresponen a 14 gens canònics i 33 lncRNAs. En una altra cohort de 166 mostres de tumors de carcinoma hepatocel·lular es manté el percentatge de pacients que els expressen.
D’aquests 47 transcrits, n’hi ha un de sol, LINC02315 que és expressat en el tim. L’expressió d’aquest transcrit en aquest òrgan limfoide toràcic és senyal d’una tolerància general pel sistema immunitari.
La majoria dels transcrits de gens codificants tendeixen a agregar-se en el mateix grup de pacients. Això suggereix una via comuna de mecanismes d’activació de l’expressió gènica. En canvi, els lncRNAs es troben més esparsos entre pacients.
Dels 14 gens canònics d’aquesta llista, n’hi ha 11 que es troben en el cromosoma X. En canvi, els 33 lncRNAs es troben més ben repartits pel genoma. Ara bé, 21 lncRNAs es troben superposats amb HERVs. En hepatòcits, les regions genòmiques que contenen HERV es troben normalment silenciades. En la transformació tumoral hi ha una supressió d’aquest silenciament, i és possible que sigui per aquesta via que els lncRNAs esmentats esdevenen específics de tumor.
Dades immunopeptidòmiques
Dels 33 lncRNAs de la llista, n’hi ha 17 pels quals Camarena et al. han trobat signatures de traducció en les dades de Ribo-Seq de la cohort HCC4. D’aquests darrers 17 lncRNAs, n’hi ha 12 que codifiquen pèptids esmentats en estudis immunopeptidòmics. Encara hi ha un tretzè, LINC01419, que Camarena et al. identifiquen en l’immunopeptidoma de carcinoma hepatocel·lular.
D’especial interès són LINC00221 i LINC02241, que ja havien estat trobats en el marc d’IEAtlas.
Comptat i debatut hi ha 10 lncRNAs (LINC01980, AC025254.1, LINC02806, LINC02476, LINC02506, AL162413.1, LINC00221, LINC01287, AC079466.1, i LINC01419) que són expressats específicament en tumors en més del 20% dels membres de la metacohort. Aquest llindar només el superen cinc gens canònics: MAGEA1, MAGEA3, SSX1, DCAF4L2, i MAGEC2.
El més rellevant és veure que en fer entrar els ncORFs en aquesta mena d’estudis es multiplica el nombre d’antígens específics de tumor. Camarena et al. ofereixen també criteris per seleccionar els més rellevants per dissenyar estratègies d’immunoteràpia per al major nombre de pacients.
Pel que fa a la patologia del càncer, encara s’hauria d’aprofundir més en el rol específic d’alguns d’aquests lncRNAs. L’expressió específica de tumor d’alguns lncRNAs s’entén en el marc de la desregulació epigenètica que acompanya la transformació tumoral.
Lligams:
– Microproteins encoded by noncanonical ORFs are a major source of tumor-specific antigens in a liver cancer patient meta-cohort. Marta E. Camarena, Patrick Theunissen, Marta Ruiz, Jorge Ruiz-Orera, Beatriz Calvo-Serra, Robert Castelo, Carla Castro, Pablo Sarobe, Puri Fortes, Júlia Perera-Bel, M. Mar Albà. Science Advances (2024).
Des de la Mediterrània 