La nacra (Pinna nobilis) és el bivalve endèmic més gros de la Mar Mediterrània. En els darrers anys les poblacions de nacra pateixen un declivi degut a mortalitats massives. Entre els factors que hi ha al darrera d’aquestes mortalitats hi ha el paràsit Haplosporidium pinnae. Ara bé, algunes poblacions mediterrànies han pogut resistir aquests embats. Hom pensa en general que aquesta resiliència és deguda a condicions ambientals locals. Per fer front a aquest retrocés, s’han bastit programes que capturen juvenils de nacra de zones menys afectades i els transporten a zones afectades. Ara bé aquests programes requereixen destriar entre P. nobilis i l’espècie propera P. rudis. Gaetano Catanese, col·laborador del grup de recerca de Recursos marins renovables i medi ambient (RECUMARE) del Laboratori d’Investigacions Marines i Aqüicultura (LIMIA), del Port d’Andratx, ha encapçalat una recerca per desenvolupar un mètode múltiplex molecular per identificar les espècies P. nobilis i P. rudis i els híbrids entre les dues. En un article a Ecology and Evolution, Catanese et al. expliquen que aquest mètode es basa en l’ús d’encebadors específics d’espècie adreçats a regions ITS (espaiador transcrit intern). L’han aplicat a mostres de bivalves d’arreu de la Mediterrànies. Així, aïllaren l’ADN d’aquestes mostres, amplificaren i seqüenciaren les ITS i ho analitzaren filogenèticament, confirmant que el mètode permet la diferenciació entre espècies. P. nobilis, P. rudis i els híbrids P. nobilis x rudis mostraven amplicons diferents sota aquests encebadors. La tècnica, doncs, és valuosa per a la monitorització i maneig de la hibridació.
Nacra fotografiada per Hectonichus a Levanto, Ligúria, el 15 de maig del 2007.
La nacra, espècie amenaçada
Gaetano Catanese ha liderat la concepció d’aquest estudi, l’anàlisi formal i la metodologia. Ha ajudat en l’adquisició de fons i participat en la investigació i edició final de l’article.
Maite Vázquez-Luis, del Centre Oceanogràfic de Balears (IEO-CSIC), ha ajudat en l’adquisició de fons i participat en la investigació, obtenció de recursos i redacció de l’article. Ha liderat l’administració del projecte.
Salvatore Giacobbe, de la Università Degli Studi di Messina, ha participat en la investigació, obtenció de recursos i redacció de l’article.
José Rafael García-March, de l’Institut d’Investigació en Medi Ambient i Ciència Marina (IMEDMAR-UCV, amb seu a Calp), ha participat en la investigació, l’administració del projecte, l’obtenció de recursos i la redacció de l’article.
Maria Zotou, de la Universitat de l’Egeu, amb seu a Mitilene, ha participat en la investigació, obtenció de recursos i la redacció de l’article.
Prado Patricia (UCV Calp, Institut d’Estudis Professionals Aqüícoles i Ambientals de Catalunya-IEPAAC-Tarragona i IRTA-La Ràpita) ha participat en la investigació, obtenció de recursos i la redacció de l’article.
Orestis Papadakis (Mitilene) ha participat en la investigació, obtenció de recursos i la redacció de l’article.
José Tena-Medialdea (UCV Calp) ha participat en la investigació, obtenció de recursos i la redacció de l’article.
Stelios Katsanevakis (Mitilene) ha participat en la investigació, obtenció de recursos i la redacció de l’article.
Amalia Grau (IRFAP LIMIA) ha liderat l’adquisició de fons i ha participat en la investigació, obtenció de recursos i la redacció de l’article.
La recerca s’ha realitzat en el marc del projecte europeu BIODIV IFE PINNARCA (NAT/ES/001265). Els autors agraeixen els permisos obtinguts de la Conselleria de Agricultura, Pesca i Medi Natural – Govern de les Illes Balears, i el suport de la Provincia Regionale di Messina. També agraeixen el suport rebut de col·legues, especialment en el treball de camp.
L’article fou tramès per Catanese a Ecology and Evolution el 23 de maig del 2024. Després d’una revisió completada l’1 d’agost, l’article fou acceptat el dia 12 i publicat el 26.
En els darrers anys, la nacra (Pinna nobilis), bivalve endèmica de la Mar Mediterrània, ha patit un retrocés com a conseqüència d’una mortalitat massiva, ràpida i generalitzada. Hom ha proposat diverses causes d’aquesta mortalitat, però en general hom pensa que es tractaria d’una combinació de factors integrada per patògens, paràsits o estressors ambientals. Entre els paràsits sospitosos hi ha el protozou Haplosporidium pinnae, detectat en nacres afectades. Entre els patògens hi hauria un virus d’ARN d’infecció lenta que conduiria a un afebliment de les nacres, que tornarien més susceptibles als paràsits.
En els darrers anys, la difusió de H. pinnae ha anat en creixement i ha arribat a desembocadures de rius, golfs i llacunes litorals on no havia estat descrit. La sequera del 2023, per exemple, contribuí a trencar els gradients de salinitat que li feien de barrera al Delta de l’Ebre.
H. pinnae és un paràsit estricte de P. nobilis. No pot infestar, per exemple, espècies properes com P. rudis.
Algunes poblacions de P. nobilis semblen no gaire tocades per la mortalitat massiva. Potser això es deu a condicions ambientals locals, com ara una temperatura reduïda, una salinitat baixa o, paradoxalment, una salinitat massa alta. Aquestes condicions ambientals dificultarien l’acció dels patògens o promourien la resiliència de les nacres a aquesta acció. Un exemple el tenim entre les nacres de la Mar del Màrmara, on la salinitat és inferior al de la Mediterrània. Aquests ‘refugis’ poden ser rellevant en una repoblació natural, ja que les larves de P. nobilis poden ser transportades a centenars de quilòmetres del seu lloc d’origen per corrents marins.
Existeixen diferents projectes conservacionistes per a les nacres. Alguns d’ells contemplen la monitorització de la reproducció de la nacra per poder recrutar juvenils amb els qui fer campanyes de reintroducció. Alternativament, els juvenils capturats poden ser mantinguts en captivitat prou temps com per fer-hi triatges per a patògens que orientin aquesta repoblació artificial.
Els juvenils del gènere Pinna presenten uns trets distintius en les petites closques. Ara bé, es fa difícil distingir entre P. nobilis i P. rudis en aquesta fase. P. rudis és una espècie difosa des de la Mar Carib a l’Atlàntic oriental, però que també es pot trobar ocasionalment a la Mar Mediterrània. En els darrers anys, hom constata una expansió de P. rudis a la Mediterrània, ocupant llocs que ha deixat buit el retrocés de P. nobilis. Hom ha observat també espècimens que semblen un creuament entre P. nobilis i P. rudis.
La hibridació pot comportar la creació de noves poblacions. També pot comportar la introgressió de gens específics que promoguin la divergència adaptativa. Ara bé, també cimportar l’erosió de genotips nadius i augmenta el potencial invasiu de certes espècies.
Existeixen mètodes d’identificació ràpida per tècniques moleculars que distingeixen entre P. nobilis i P. rudis. Ara bé, es tracta de seqüenciar o amplificar fragments d’ADN mitocondrial, la qual cosa reflecteix el llinatge matern però pot no capturar el fenomen de la hibridació.
Una alternativa és la seqüenciació de tres fragments del gen ribosomal 28S. Determinades posicions nucleotídiques són típiques de P. nobilis i P. rudis, i la coexistència d’aquestes dues alternatives seria indicativa d’un híbrid. Ara bé, aquesta tècnica és costosa i no sempre de fàcil interpretació.
Catalanese et al. proposen fixar-se en una regions concretes dels gens ribosomals 18S i 28S. Es tracta de les regions espaiadores transcrites internes (ITS), unes regions que són transcrites de l’ADN gènic a l’ARN transcrit immadur, però que no passen després a l’ARN que s’integrarà en els ribosomes. ITS1 i ITS2 separen de fet els gens ribosomals 18S, 28S i 5,8S. L’amplificació i seqüenciació d’ITS és utilitzada en estudis de diversitat d’organismes eucariòtics. ITS1 és més llarga i més variable que ITS2, i el seu ús conjunt fa més robusta la tècnica molecular.
Catanese et al. dissenyaren encebadors específics d’espècie per a les regions ITS de P. nobilis i P. rudis. Els amplicons resultants tenen mides diferents segons l’espècie. En híbrids de generació F1, apareixerien els dos amplicons.
Quaranta-una mostres obtingudes per biòpsia
Catanese et al. utilitzen mostres procedents de 41 biòpsies realitzades entre el 2021 i el 2023. D’aquestes 41, 25 són de P. nobilis i 16 de P. rudis. Les 25 de P. nobilis procedien del Delta de l’Ebre (5), Calp (5), Illes Balears (4), Messina (5) i Lesbos (6). Les 16 de P. rudis procedien de Calp (4), Illes Balears (1), Messina (3) i Creta (8). Tres possibles híbrids foren recollits de les Illes Balears.
Les biòpsies consisteixen en una porció del mantell d’un individu, tallat in situ i mantingut en etanol absolut. Aquestes biòpsies s’obtenien d’individus adults.
En l’estudi també s’inclouen dues mostres de cadascuna d’aquestes espècies:
– Pinctada sp., recollida de Messina.
– Spondylus gaederopus, recollida de Messina.
– Malleus sp., recollida de Messina.
– Isognomon sp., recollida de Messina.
– Atrina pectinata, recollida de Calp.
La presa de mostres comptà amb els permisos necessaris de les autoritats nacionals i/o locals. La identificació es va fer principalment per característiques morfològiques.
A partir d’una alíquota de 30 grams de teixit es feia una extracció d’ADN genòmic amb el kit de Macherey-Nagel.
Per a l’amplificació de les regions ITS es feien servir el parell d’encebadors Pinna_ITSF (5’-CCGTTGAACCTCCTTCGTGCT-3′) i Pinna_ITSR (5’-GGCTCTTCCCGCTTCACTC-3′). Les seqüències foren dissenyades d’acord amb les dades de GenBank. En el cas d’Atrina s’utilitzaren encebadors diferents.
Les reaccions de PCR es feien en un volum de 20 μL. S’hi afegien 50 ng d’ADN. La PCR incloïa 35 cicles. Els productes finals eren purificats amb el kit de Metabion i seqüenciats pel mètode de Sanger a la casa Secugen el 15 de febrer del 2024.
Paral·lelament es feia una identificació per ADN mitocondrial.
Per a l’amplificació específica de P. nobilis s’utilitzen els encebadors PN_267 F (5′-ACGCACGGAAAAAAAACGACAAAAAGTC-3′) i PN_267 R (5′-TTGAACCTCGGCCCCACCC-3′). Per a la de P. rudis PR_102 F (5′-CCCCGTAGATTCGTTCAACACCAC-3′) i PN_102 R (5′-CACCGACAACAACCCCCCA-3′). L’amplicó de P. nobilis té una mida de 267 parells de nucleòtids, i el de P. rudis una de 102 bp.
La PCR múltiplex barreja aquests parells de nucleòtids. Contempla també 35 cicles. Els productes finals són carregats en gels d’agarosa d’alta resolució, tenyits amb GelRed. Per determinar els pesos moleculars s’utilitza l’escala d’ADN de Norgen.
Aquest mètode és aplicat a mostres de juvenils capturats en col·lectors i també a mostres d’adults amb aparença d’híbrids.
Seqüències de regions ITS
Les seqüències de regions ITS realitzades per Catanese et al. han estat publicades a GenBank: P. nobilis (access. n. LC794141), P. rudis (LC794142); Pinctada sp (LC814847-LC814850); Isognomon sp. (LC814845); Malleus sp. (LC814846). Les seqüències Spondylus gaederopus (LC814851-LC814852) i Atrina pectinata (LC814844) coincideixen amb les prèviament publicades a GenBank. El contingut en GC varia del 51% al 59%.
Aquestes seqüències van de 1046 a 1377 bp. A dins hi ha una regió més conservada, corresponent al gen ribosomal 5,8S.
La comparació entre P. nobilis i P. rudis resulta en 107 posicions polimòrfiques, de les quals 67 són insercions-delecions i 40 substitucions nucleotídiques. Val a dir que Catanese et al. no han trobat diferències intraspecífiques entre els espècimens analitzats.
L’anàlisi filogenètica mostra que les dues espècies de Pinna cauen en el mateix grup, clarament separades de la resta.
En el disseny dels encebadors PN_267 s’aprofiten les diferències en les posicions 320-326 i 546-549 de la regió ITS. Això resulta en un amplicó de 267 parells de nucleòtids, específic de P. nobilis.
En el disseny dels encebadors PR_102 s’aprofiten les diferències en les posicions 545-547 i 609-612. Resulta un amplicó de 102 bp, específic de P. rudis.
L’aplicació de la PCR múltiplex a mostres de bivalves que no són del gènere Pinna resulta en una manca d’amplificació.
En aplicar-la a mostres de P. nobilis hom troba el fragment de 267 bp. En aplicar-la a mostres de P. rudis apareix el fragment de 102 bp. En aplicar-la als tres suposats híbrids, hom troba l’amplificació dels dos fragments:
Aquests tres híbrids presenten un ADN mitocondrial de P. nobilis. Això és indicatiu d’una transmissió uniparental de l’ADN mitocondrial.
La hibridació natural en la nacra
Tendim a veure l’evolució com una qüestió de cladogènesi, és a dir de generació de noves espècies a partir de l’escissió d’una espècie anterior. Però no hem d’oblidar que l’especiació és un procés gradual en el curs del qual hi ha ample espai per a la hibridació i que aquesta juga un rol també fonamental. La hibridació natural influeix en la diversitat genètica i en els processos d’adaptació i d’especiació.
La hibridació és la interacció genètica entre individus d’espècies diferents. Hom calcula que aquest procés té lloc en el 10% de les espècies animals, particularment en aquelles que han resultat de processos d’especiació recents. Ara bé, també pot haver hibridació en ocasions entre espècies de gèneres diferents.
N’hi ha prou amb un nivell moderat d’hibridació entre llinatges perquè hi hagi una introgressió de gens d’un llinatge a l’altre. La introgressió pot veure’s afavorida selectivament i en aquest cas perdurarà.
La hibridació i la introgressió poden comportar, doncs, per a espècies amenaçades una entrada de diversitat genètica i de major capacitat d’adaptació. Ara bé, també pot comportar el desplaçament d’endemismes. Resulta vital monitoritzar aquest procés, destriar situacions que porten a la generació híbrids infèrtils o subfèrtils de les que poden donar lloc a noves variants.
Catanese et al. confirmen que hi ha híbrids en el gènere Pinna entre P. nobilis i P. rudis. Ara bé, no se sap encara si aquests híbrids són fèrtils o infèrtils. Per això encara és d’hora per arribar a conclusions sobre el futur d’aquesta hibridació. P. rudis no ha patit les mortalitats massives registrades en P. nobilis, però no sé sap si això és degut a una major capacitat d’adaptació a canvis ambientals o a una menor presència de patògens que l’afectin. Els híbrids entre les dues espècies semblen resistents a H. pinnae. En la resistència a H. pinnae podrien jugar un paper gens del sistema immunitari com TLR-7, TLR-6 i TLR-4.
La tècnica de Catanese et al. permet la detecció d’híbrids de primera generació (F1). Més complicada seria la detecció, si n’hi ha, de descendents d’aquests híbrids, en la que caldria analitzar diferents gens i no únicament la regió ITS. De tota manera, és una tècnica que pot ajudar en les tasques de monitorització, conservació i repoblació de la nacra.
Lligams:
– Internal transcribed spacer as effective molecular marker for the detection of natural hybridization between the bivalves Pinna nobilis and Pinna rudis. Gaetano Catanese, Maite Vázquez-Luis, Salvatore Giacobbe, José Rafael García-March, Maria Zotou, Prado Patricia, Orestis Papadakis, José Tena-Medialdea, Stelios Katsanevakis, Amalia Grau. Ecol. Evol. 14: e70227 (2024).
Des de la Mediterrània 