Si la genètica ens pot ajudar a identificar un individu, l’epigenètica ens pot donar informació més concreta sobre la seva situació. El genoma, a grans trets, és idèntic per a totes les cèl·lules d’un mateix individu, però l’epigenoma, és a dir les modificacions que van més enllà de la seqüència d’ADN, varia de teixit a teixit, i també al llarg del cicle vital. De les modificacions epigenètiques destaca la metilació, i hom ha proposat utilitzar-la com a base en tècniques de determinació de l’edat d’un individu. Certament, l’edat també es manifesta en un factor purament genòmic com és la longitud dels telòmers, però potencialment la metilació genòmica fonamentaria un mètode més acurat. Conèixer l’edat d’un animal és rellevant en programes de conservació, i si bé amb aquesta finalitat s’han fet servir diversos mètodes tradicionals, convé disposar de mètodes que siguin universals, no-invasius i precisos. Eliot Ruiz, que fa la tesi doctoral al MARBEC de la Universitat de Montpelhièr investiga, sota la supervisió de Loïc Pellissier i de Camille Albouy, investiga la possibilitat d’emprar l’ADN ambiental per fer estimacions d’edat en peixos. Aquest mètode compleix el criteri de no ésser invasiu. En un article a la revista Ecology and Evolution, Ruiz et al. l’apliquen sobre la fase larval (de 10 a 24 dies després de l’eclosió) de llobarro (Dicentrarchus labrax) d’aqüicultura. Fan, doncs, extracció de l’ADN ambiental de les instal·lacions, i hi apliquen una tècnica de seqüenciació de tercera generació (amb nanopor i sense amplificacions) amb la que poden detectar directament diversos tipus de modificacions, com a ara la metilació de la citosina i de l’adenina en tots els contextos i al llarg de tot el genoma. Troben que els llocs de metilació que reflecteixen l’edat són exclusius del genoma mitocondrial. Com que coneixen l’edat real de les larves, poden comprovar la precisió d’un rellotge epigenètic, que estimen en un error absolut medià de 2,6 dies. Pot semblar un error força gros, però ja és més baix que la d’altres rellotges tradicionals o moleculars aplicats a larves o a adults de llobarro. Admeten que el dinamisme epigenòmic de l’estat larvari pot haver-ho facilitat. També són conscients que abans de traslladar-ho a l’estudi de camp de poblacions naturals de llobarro caldrà una validació robusta de tota la metodologia.
Ruiz et al. treballen a partir d’ADN ambiental d’una instal·lació d’aqüicultura, que seqüencien i analitzen bioinformàticament.
L’edat epigenètica i l’edat cronològica
Eliot Ruiz ha liderat la conceptualització d’aquesta recerca, així com l’anàlisi formal, la metodologia, els recursos, el programari, la visualització, la redacció de l’esborrany de l’article, i la revisió i edició finals. Fabien Leprieur ha participat en la supervisió i en la revisió i edició de l’article. Gérard Sposito ha fornit recursos i participat en la supervisió. Martina Lüthi ha contribuït en la metodologia, els recursos i la redacció final de l’article. Michel Schmidlin ha participat en la metodologia, recursos i redacció. Jacques Panfili ha participat en la supervisió i la redacció. Loïc Pellissier participà en la conceptualització, adquisició de fons i redacció. Camille Albouy ha participat en la conceptualització, adquisició de fons, administració de projecte, supervisió i redacció.
Els autors agraeixen a l’OREME l’hostatjament dels experiments i l’aportació de larves de llobarro. També tenen paraules d’agraïment per als membres del Centre de Diversitat Genètica de l’ETH Zürich, i en particular per a Silvia Kobel i Aria Minder en la preparació de genoteques i seqüenciació.
En la caracterització de poblacions animals del medi natural conèixer l’edat dels individus és una de les informacions més rellevants. Si pensem en poblacions de peixos, l’estimació de l’evolució de l’estructura d’edat al llarg dels anys és vital per gestionar-ne l’explotació i la conservació. Poder aconseguir una informació fidel de l’edat dels individus ajuda a determinar la durada de components del cicle vital com ara fase de dispersió, la maduració reproductiva, la taxa de creixement o la taxa de mortalitat. Per a les estratègies de conservació això ajuda a identificar els components més vulnerables (zones de posta o de cria, primers juvenils, adults més fecunds, etc.).
Clàssicament, l’edat de peixos salvatges s’estima d’acord amb la mida. La relació entre mida i edat es pot precisar més mitjançant tècniques de marca-recaptura. Hom pot recórrer també a variables morfològiques (esclerocronologia) o bioquímiques (pigments, hormones). Ara bé, tots aquests mètodes clàssics tendeixen a ésser específics de grup, ofereixen poca resolució, no sempre són factibles o eficients, i solen ésser costosos.
A principi de segle hom proposà mètodes genètics d’estimació de l’edat com ara la longitud dels telòmers. Els telòmers són els extrems dels cromosomes. En els llinatges cel·lulars somàtics la longitud telomèrica tendeix a reduir-se a mesura que es fan més divisions cel·lulars. Hom ha aconseguit aplicar aquesta tècnica a la determinació de l’edat en més de 100 espècies, començant per l’espècie humana.
Fa una mica més de deu anys comença a agafar volada la determinació de l’edat per mètodes epigenètics. La relació entre edat i epigenètica ha estat estudiada en vora un centenar d’espècies i, en termes general, sembla més precisa que no pas la relació entre edat i longitud telomèrica.
Si la genètica consisteix, a nivell molecular, en la successió de bases nucleotídiques A, T, G i C, de l’ADN l’epigenètica són canvis que no afecten aquesta seqüència. Poden consistir en modificacions d’histones, que són les proteïnes encarregades del plegament de l’ADN. Poden consistir també en canvis en l’organització de la cromatina (el complex que formen l’ADN, les histones i altres proteïnes dels nuclis cel·lulars). També hi poden afegir el rol de l’ARN no-codificant. No obstant el mecanisme epigenètic més ben conegut és la metilació directa de l’ADN. La metilació de l’ADN varia, entre d’altres factors, per l’edat i així és com s’han pogut construir ‘rellotges epigenètics’.
Val a dir que la metilació de l’ADN és un procés dinàmic i reversible. Consisteix en la unió d’un grup metil o derivat (hidrometil, formil, carboxil) a qualsevol dels quatre tipus de nucleòtids. L’evolució de la metilació de l’ADN d’acord amb l’edat de teixits o d’organismes és relativament consistent. Existeixen així llocs genòmics la metilació dels quals és diferencial segons l’edat, en una relació que es manté en diferents grups biològics. És notable que rellotges epigenètics construïts per a mamífers tinguin validesa per a peixos osteïctis, quan el darrer avantpassat comú dels dos grups va viure fa 433 milions d’anys.
Les tècniques de seqüenciació d’ADN clàssiques no discriminaven per l’estat de metilació dels nucleòtids. Així els nucleòtids metilats havien d’ésser detectats amb l’ús d’anticossos específics o d’enzims de restricció. Més endavant hom acoblà a la seqüenciació d’ADN una tècnica de tractament amb bisulfit que permetia la identificació de citosines metilades. No ha estat, però, fins a l’arribada de la seqüenciació de tercera generació que és possible la detecció directa de bases metilades sense alterar l’ADN. Això es fa aprofitant els patrons elèctrics distintius associats als grups metil, o bé als patrons diferencials de velocitat. Així hom pot identificar llocs de metilació com 4mC, 5mC, 5hmC o 6mA.
Aplicar aquestes metodologies a l’anàlisi d’ADN ambiental obre noves perspectives. L’ADN ambiental consisteix en les traces genètiques que els organismes deixen en l’aigua o els sediments. Extreure’n informació és una forma assequible i no-destructiva de monitoritzar la biodiversitat de comunitats ecològiques. L’ADN ambiental ens pot ajudar a valorar l’estructura genètica de poblacions, i així modelitzar-ne la demografia i la dispersió. El repte és aconseguir a partir d’ADN ambiental informació precisa sobre els individus com ara el sexe, l’edat, la condició fisiològica, etc. L’epigenètica d’ADN ambiental basada en seqüenciació de tercera generació aplicada a tot el genoma ofereix la possibilitat d’accedir a aquesta informació.
De particular interès és la monitorització de l’edat en l’avaluació de les poblacions de peixos ossis actinopterigis. Cal recordar que encara avui més de la meitat del peix que consum la població prové de la pesca de fins a 2200 espècies diferents. Actualment l’edat s’avalua a través del comptatge diari o de l’augment estacional d’otòlits (les pedres que s’hi formen a les orelles). Ara bé, aquesta determinació dels otòlits implica la captura i mort de l’animal. A més, no funciona per a totes les espècies de peixos. Cal afegir també els biaixos metodològics, i el temps d’anàlisi.
Hom ha cercat tècniques alternatives a través de l’anotació automatitzada, l’espectroscopia o la datació radiomètrica (per radiocarboni). La resolució màxima d’aquestes tècniques no va més enllà d’un any per als peixos adults.
Els rellotges epigenètics serien especialment útils en la determinació de l’edat de larves i juvenils. Utilitzar-hi com a base l’ADN ambiental possibilitaria el desenvolupament d’una tècnica no-invasiva. La seqüenciació de tercera generació no requereix una amplificació prèvia i permet la detecció de múltiples tipus de metilació.
En el cas de les larves de llobarro (Dicentrarchus labrax), hom ha desenvolupat un rellotge epigenètic fonamentat en la seqüenciació d’ADN tissular. Traslladar-ho a l’ADN ambiental ajudaria a aprofitar-lo per a poblacions naturals d’aquesta espècie, que actualment pateixen un fort declivi. Cal recordar que el llobarro és el sisè peix ossi marí en aqüicultura, i que en el 2020 es capturaren 244.000 tones de llobarros salvatges. Les larves són l’estadi més vulnerable, sense el qual no hi ha ni reabastiment de poblacions ni connectivitat entre elles.
Les larves de llobarro en aqüicultura creixen en un ambient controlat, de manera que són ideals per desenvolupar-hi un rellotge epigenètic d’ADN ambiental.
L’OREME de Seta
Els experiments es realitzaren en una bassa de larves de llobarro de la instal·lació aqüícola de l’OREME de Seta. Les larves procedien de Fermes Marines du Soleil, de Los Banhs de Balaruc, i arribaven a l’OREME 5 dies després de l’eclosió.
La densitat de les larves en el tanc era valorada diàriament. Des del setè dia d’edat (18 de novembre del 2022) fins el dia 28 (9 de desembre del 2022) es prenien mostres ambientals del tanc cada 2 o 3 dies, de manera que hi hagué un total de 9 dies de mostreig.
Per limitar la contaminació de les mostres amb ADN humà, cada experiment es duia a terme en una zona demarcada, on era obligatori l’ús de guants de làtex, de mascaretes quirúrgiques, bates de laboratori i xarxa per als cabells. La primera fase del procediment consistia en la descontaminació de tots els materials i dels tancs amb lleixiu al 10%, esbandits després amb aigua destil·lada. Seguidament es transferien al tanc 16 L d’aigua marina que contenia les larves. S’obria llavors l’embornal del tanc per deixar-hi passar 13 L que eren substituïts per 13 L d’aigua marina filtrada. Aquesta operació era repetida tres vegades.
Era després d’això que es feien tres rèpliques en recipients de 5 L, que eren segellats amb parafilm. Un quart recipient servia de control ambiental, en el sentit que no rebia larves.
Al cap de 30 minuts es filtraven 2-3 L de cada recipient utilitzant una bomba peristàltica. Així en total, l’aigua contenia l’ADN desprès de les larves durant 30-90 minuts en total. Després de la filtració, les càpsules dels filtres rebien 5 mL d’una solució tampó de lisis.
L’extracció de l’ADN es va fer en les primeres dues setmanes posteriors als experiments. Val a dir que en tres casos, l’extracció no fou possible perquè les càpsules es trencaren en transportar-les. Val a dir que en els filtres dels controls ambientals no es detectà gens d’ADN.
Les tres (o dos) rèpliques de l’extracció d’ADN eren abocades al mateix tub Eppendorf. En total hi hagué nou mostres i nou controls, ordenats per l’edat de les larves (de 7 a 28 dies). En aquesta fase calia que hi hagués un mínim de 400 ng d’ADN, la qual cosa no fou possible més que en tres mostres. Aquesta baixa quantitat d’ADN obligà a realitzar un pas de fragmentació amb boletes d’òxid de zirconi de 1,4 mm. Descartat el pellet proteic, el contingut d’ADN en el sobrenedant era encara massa baix, i calgué un pas de concentració per evaporació en calor.
La genoteca de l’ADN ambiental es preparà amb el Native Barcoding Kit 24V14 de Nanopore. L’anàlisi de la genoteca final en TapeStation 4150 mostravà un fragment pic de 7 kb, i que el 94,19% dels fragments feien entre 3058 i 23454 bp. La genoteca fou carregada en el seqüenciador.
Les seqüències obtingudes foren filtrades i agregades en un arxiu FASTA. Amb el genoma total de referència del llobarro (RefSeq: GCF_905237075.1) era possible identificar les seqüències corresponent, alhora que s’hi descartava la presència del llobarro pigallat (D. punctatus).
Amb el programa Dorado cercaren la presència de seqüències de metilació 5mC, 5mCG_5hmCG i 6mA. Així obtingueren un resum de metilació per a cada lloc genètic.
Seguidament muntaren el rellotge epigenètic.
La seqüenciació d’ADN ambiental
Per cada mostra s’aconseguí de mitjana uns 303 ng d’ADN. El rendiment d’extracció depenia en gran mesura de la biomassa de larves en el tanc original. Tot i la petita quantitat d’ADN, la seqüenciació genera un total de 1,8 milions de lectures, amb una longitud mitjana de 1,85 kb.
La presència de lectures d’ADN de llobarro es registrava tant en les mostres com en els controls, però en aquests darrers els valors eren molt més baixos.
Pel que fa a la presència d’ADN humà, aquesta era molt baixa (tan sols un 0,1% de les lectures). Més remarcable era la presència d’ADN de bacteris (>30% de lectures) i de fongs (>23%). En total un 94% de les lectures de les mostres no es corresponien al llobarro.
Les lectures del llobarro discrepaven dels genomes de referència en més d’un 0,7%.
Els llocs de genètics de metilació dependent de l’edat
La metilació afecta a un 0,8% de les citosines o adenines. Això suposa un total de 99.187 llocs de modA i de 154.772 llocs de modC. El 84% dels modC tenien lloc en un context CpG. D’aquests CpG, un 5,6% eren hidroximetilats.
En total s’identificaren 493 llocs amb metilació diferencial per l’edat. N’hi havia més de modA que de modC. Tots aquests 493 llocs es troben en el genoma mitocondrial, cosa remarcable si atenem que aquest tan sols representa el 0,06% de les citosines i adenines.
Aquests 493 llocs es troben únicament en certs gens de l’ADN mitocondrial. El 73% són en gens organitzats en codons, com és el cas dels gens ND1, ND5, COX1 i ND2. També és remarcable la presència d’aquests llocs en gens tRNA.
La metilació d’aquests llocs arriba a un pic a 10 dies després de l’eclosió.
La predicció eficient de l’edat larval
La validació creuada dels rellotges epigenètics genera un error de vora 4 dies. L’entrenament dels rellotges acaba per reduir aquest error fins a 2,61 dies.
Els rellotges epigenètics es basen especialment en gens com tRNA-Trp o com ND2. Alguns dels llocs de metilació de tRNA-Trp comencen amb un nivell de metilació del 0% a 10-14 dies d’edat per arribar a 8,5% a 17 dies d’edat i saltar al 100% a 19-24 dies.
El potencial dels rellotges epigenètics sobre mostres ambientals
Ruiz et al. mostren que és possible utilitzar ADN ambiental per posar a l’hora rellotges epigenètics. La precisió arriba a ésser millor que rellotges epigenètics basats en ADN tissular o que rellotges genètics telomèrics.
Ruiz et al. atribueixen aquesta precisió al fet d’haver-se centrat en estadis juvenils. En aquesta etapa la metilació de l’ADN és molt dinàmica. Als 8 dies d’edat les larves de llobarro comencen a alimentar-se exògenament i s’inicia el desenvolupament de les aletes. Als 10 dies d’edat apareix la bufeta de vidre i la respiració branquial.
Un avantatge d’aquesta metodologia de desenvolupament de rellotge epigenètic és que la selecció de llocs o és direccional i abasta un ventall de modificacions. Una limitació, però, és la imprecisió de la seqüenciació genètica, que en el cas de Ruiz et al. supera el 0,7%.
Xarxes neurals profundes podrien investigar amb més detall l’evolució dels patrons de metilació amb l’edat, tot relacionant-la amb els processos biològics subjacents.
Pel que fa al fet que el rellotge epigenètic de Ruiz et al. es fonamenti exclusivament en l’ADN mitocondrial, els autors recorden que el genoma mitocondrial es troba en un major número de còpia. Alhora, dins dels mitocondris ja una major preservació de la metilació de l’ADN.
Lligams:
– Environmental DNA Epigenetics Accurately Predicts the Age of Cultured Fish Larvae. Eliot Ruiz, Fabien Leprieur, Gérard Sposito, Martina Lüthi, Michel Schmidlin, Jacques Panfili, Loïc Pellissier, Camille Albouy. Ecol. Evol. 15: e70645 (2025).
Des de la Mediterrània 