El grup de recerca de Lípids i patologia vascular de Concepción Vicenta Llorente Cortés, a l’Institut d’Investigacions Biomèdiques de Barcelona, és especialment interessat en processos d’acumulació d’esters de colesterol en el miocardi com a mecanisme patogènic de les alteracions cardíaques vinculades a la síndrome metabòlica. La base molecular d’aquesta acumulació és la interacció entre les lipoproteïnes de curs sanguini riques en colesterol i els receptors corresponent de la cèl·lula muscular cardíaca, el cardiomiòcit. Aquesta interacció és vehiculada per l’apolipoproteïna B100 (ApoB100) de part de la lipoproteïna i pel domini CR9 de la proteïna 1 relacionada amb el receptor de LDL (LRP1) de part del cardiomiòcit. En aquesta interacció juga un paper crucial la seqüència P3 de la LRP1 que va de la glicina-1127 a la cisteïna-1140. Anticossos que reconeixen aquesta seqüència P3 són capaços d’inhibir la interacció entre les lipoproteïnes riques en colesterol i la LRP1, i de retruc impedeixen l’acumulació intracel·lular d’esters de colesterol en cardiomiòcits d’animals sotmesos a una dieta rica en greix i en colesterol. Però fins a quin punt és fisiològicament rellevant l’acumulació intracel·lular de colesterol en el cardiomiòcit? Aleyda Benítez Amaro és la primera autora d’un article publicat al número de maig del Journal of Lipid Research en el que presenten un estudi realitzat en conills alimentats amb una dieta rica en greix i colesterol. Homogeneïtzaren teixit cardíac d’aquests animals i per, fraccionament subcel·lular, n’isolaren els mitocondris. La cromatografia en capa fina indicava que aquesta dieta experimental induïa l’acumulació d’ester de colesterol en aquests mitocondris cardíacs. Alhora, aquesta acumulació era significativament reduïda amb anticossos anti-P3. Mitjançant microscòpia electrònica de transmissió comprovaren que la dieta experimental provocava canvis morfològics en els mitocondris de cardiomiòcits, que eren revertits amb els anticossos anti-P3. Els anticossos anti-P3 promouen una interacció més extensa entre mitocondris i gotes lipídiques, alhora que aquestes gotes tenen un diàmetre superior i tenen un aspecte més dens en les electromicrografies. L’anàlisi Seahorse de la capacitat respiratòria dels mitocondris cardíacs mostra que la dieta rica en greix redueix les ratios d’activitat CI/CIV i CII/CIV, mentre que els anticossos anti-P3 restauren l’activitat CII/CIV. Sembla doncs, que els anticossos anti-P3 tenen la capacitat de reduir l’acumulació d’esters de colesterol en mitocondris de cardiomiòcits i, de retruc, millorar-ne la funció respiratòria.
Benitez-Amaro et al. han estudiat en un model de conill sotmès a una dieta rica en greix i en colesterol si això condueix a una acumulació de colesterol en els mitocondris de les fibres musculars del cor i la consegüent alteració en la bioenergètica cardíaca. Així és, però també han trobat que anticossos específics contra la LRP1 són capaços de restaurar la bioenergètica del cardiomiòcit
Metabolisme lipídic i funció cardíaca
És sabut que la malaltia cardiovascular és la principal causa global de mortalitat. En aquesta malaltia té un paper central la disfunció cardíaca. Entre els elements d’aquesta disfunció hi ha una reducció de la capacitat respiratòria mitocondrial, que és a la base d’una disrupció del metabolisme cardíac i de la producció energètica. Disfunció mitocondrial i insuficiència bioenergètica serien motors cabdals de l’inici i progressió de la disfunció cardíaca.
La musculatura cardíaca ocupa, en certa manera, un lloc intermedi entre la musculatura estriada voluntària i la musculatura llisa involuntària. La fibra muscular cardíaca o cardiomiòcit és un dels tipus cel·lulars més rics en mitocondris. Hom calcula que entre el 25 i el 30% del volum del cardiomiòcit és ocupat pel condrioma o conjunt de mitocondris.
Els mitocondris són els orgànuls responsable de la respiració oxidativa, però cal recordar que la funció mitocondrial es realitza de manera integrada amb la resta d’estructures cel·lulars. És especialment important la interacció entre mitocondris i reticle endoplasmàtic. Per exemple, membranes del reticle endoplasmàtic associades als mitocondris (MAMs) constitueixen una connexió estructural essencial en la síntesi de fosfolípids, en el transport intracel·lular, la senyalització a través d’ions calci (Ca2+), i fins i tot en la pròpia homeòstasi mitocondrial en termes d’estructura, bioenergètica i dinàmica.
Una altra interacció rellevant és la que es produeix entre els mitocondris i les gotes lipídiques (LDs). Els mitocondris vinculats a les LDs reben el nom de PDM, i tenen una bioenergètica i dinàmica diferencial respecte als mitocondris citoplàsmics. Així, els PDMs tenen una major bioenergètica manifestada en una major síntesi d’ATP i una major capacitat d’oxidació de glucosa.
En el metabolisme cardíac és essencial disposar d’una font d’àcids grassos. Aquests arriben fonamentalment a través de les lipoproteïnes de la sang. Ara bé, uns nivells elevats de colesterol associat a lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) poden afectar la funció cardíaca, particularment la funció del ventricle esquerre, responsable de bombar la sang arterial de la circulació major. Aquesta alteració funcional s’acompanya d’un augment de la massa del ventricle esquerre.
Un excés de lipoproteïnes LDL i VLDL és capaç d’induir alteracions en cultius de cardiomiòcits: canvis en la dinàmica de calci, canvis en la transmissió de senyals, canvis en l’expressió de la Ca2+-ATPasa del sarcoplasma i del reticle endoplàsmic, o canvis en les connexines.
En conills sotmesos a dietes riques en colesterol es detecta un augment de la susceptibilitat ventricular a la fibril·lació. Si bé, tendim a pensar en els efectes sobre les artèries coronàries, l’acumulació directa de colesterol en el reticle endoplàsmic del miocardi podria jugar-hi un paper rellevant.
Els mitocondris participen en el tràfic normal de colesterol dins de la cèl·lula. Ara bé, si hi ha un excés de colesterol, això pot conduir a canvis patològics en els mitocondris: disrupció de l’homeòstasi de l’oxigen, reducció de les defenses antioxidants i alteració en l’assemblatge dels supercomplexos respiratoris. Hom ha estudiat això especialment en hepatòcits i en neurones, però és menys coneguda la situació en el cardiomiòcit.
En la captació de lipoproteïnes riques en esters de colesterol per part del cardiomiòcit hi participa el receptor LRP1. A partir d’aquesta entrada, els esters de colesterol són vehiculats cap a les LDs. El grup de Llorente-Cortés ha desenvolupat anticossos que actuen contra la interacció del LRP1 amb les lipoproteïnes. Com que actuen contra la seqüència P3 de la LRP1 reben el nom d’anticossos anti-P3. En estudis previs han vist com els anti-P3 poden reduir l’acumulació intracel·lular d’esters de colesterol sense afectar l’entrada de triglicèrids.
En un model de conill sotmès a una dieta rica en colesterol, els anti-P3 són capaços de restaurar la senyalització d’insulina del múscul cardíac i d’inhibir l remodelació de matriu extracel·lular. Ara bé, quedava per veure si els esters de colesterol s’acumulen realment en els mitocondris de cardiomiòcits. També quedava per comprovar els efectes que això pogués tindre sobre la morfologia mitocondrial, les interaccions amb LDs i la funció respiratòria. Finalment, s’havia de veure si els anti-P3 podien mitigar aquestes alteracions.
Un model animal de malaltia metabòlica
L’experiment fou aprovat pel Comitè Ètic d’Experimentació Animal de l’Institut de Recerca de la Vall d’Hebron. Els animals eren aclimatats durant una setmana abans d’iniciar un tractament d’immunització amb pèptid P3. L’administració d’anticossos es realitzava cada 21 dies, amb una dosi primària i quatre dosis de record. El grup control rebia les mateixes injeccions, però d’un pèptid sense funció immunitària (IrP).
Cadascun dels dos grups (control i tractat) eren formats per 10 conills femelles de la raça New Zealand White. En aquest període d’immunització els animals seguien una dieta estàndard.
Després de la quarta dosi de record, els 20 conills eren repartits en dos grups alimentaris:
– a) un que seguia rebent el pinso estàndard, amb una composició del 17,3% de proteïna, el 16,7% de fibra i el 3% de greix.
– b) un que passava a rebre un pinso ric en greix i colesterol (HFHC), amb un 16,7% de proteïna, un 12,4% de fibra, un 7,6% de greix i un 1% de colesterol.
Així doncs, els 20 conills eren repartits en quatre grups de 5 animals cadascun:
– grup de pinso estàndard immunitzat amb IrP.
– grup de pinso estàndard immunitzat amb P3.
– grup de pinso HFHC immunitzat amb IrP.
– grup de pinso HFHC immunitzat amb P3.
Benitez-Amaro et al. seleccionaren aquest tipus de conill i el sexe femení d’acord amb estudis anteriors sobre la immunoteràpia contra l’aterosclerosi. Els conills tenen una resposta immunitària forta, i per la qual cosa sempre han estat rellevants en l’obtenció d’anticossos policlonals i, en els darrers temps, en estudis d’immunoteràpia. També és més fàcil estudiar en conills la inflamació vascular de l’aorta que no pas fer en animals més petits, com rates i ratolins.
Durant tot l’experiment es monitoritzava l’evolució del pes corporal dels animals. També es mesuraven en mostres de sèrum sanguini els nivells específics d’anticossos anti-P3 per immunoenzimoassaig.
Al final de l’estudi tots els animals foren sacrificats. L’estudi, doncs, es fonamenta en les mostres de sèrum recollides durant l’estudi i en els teixits congelats obtinguts en la necròpsia.
La NT-proBNP és una neurohormona indicativa d’insuficiència cardíaca. Els nivells de concentració sèrica de NT-proBNP són un indicatiu de dany cardíac. En cap dels animals d’aquests experiments s’arribà a un nivell superior a 5 ng/L de NT-proBNB.
El pèptid P3 utilitzat en aquests experiments és GDNDSEDNSDEENC. La seqüència P3 del conill difereix de la seqüència humana únicament en la substitució N1135S. Addicionalment, Benitez-Amaro et al. incorporen la substitució 1140C per augmentar-ne la immunogenicitat.
El pèptid IrP d’aquest estudi té la mateixa seqüència GDNDSEDNSDEENC, però en aminoàcids D-enanitiomèrics, la qual cosa el fa ‘irrellevant’ fisiològicament.
Els pèptids P3i IrP eren sintetitzats pel Laboratori de Proteòmica i Química Proteica de la Universitat Pompeu Fabra.
En acabar l’experiment, els conills eren anestesiats, i se’ls treia el cor, que era immediatament congelat i inclòs en OCT. En alguns casos es prenien trossos de teixit d’1 mm3, que eren fixats en tampó fosfat amb gluraldehid, destinats a un estudi amb microscòpia electrònica de transmissió realitzat al Parc Científic de la Universitat de Barcelona. En aquestes imatges s’avaluava l’àrea i perímetre de LDs i el percentatge de mitocondris que hi interactuaven.
Talls histològics de cor de conills alimentats amb pinso HFHC eren homogeneïtzats. Els homogenats eren centrifugats per retirar-hi nuclis i cèl·lules no-trencades. La ultracentrifugació posterior permetia la precipitació diferencial de fraccions de mitocondris i de MAMs. Mitjançant un Western blot per a marcadors específics de lisosomes (LAMP1), LDs (PLIN2), MAMs (calnexina) i mitocondris (Cyt C, VDAC) es comprovava la puresa de cada subfracció.
Alíquotes de fraccions mitocondrials eren sotmeses a una extracció de lípids. L’extracte resultant era analitzats en cromatografia de capa fina, separant-hi esters de colesterol, triglicèrids i colesterol lliure.
Alíquotes de teixit cardíac eren sotmeses a una extracció d’ARN total. Mitjançant RT-PCR es valorava en aquests extractes la presència d’ARNm dels gens LRP1, LDLR, 3-OH-3-metilgluraril-CoA reductasa i acetil-CoA-transferasa. Com a ARNm referent s’utilitzava el 18srRNA.
Talls histològics de cor eren destinats a estudis de microscòpia confocal amb tinció amb anticossos anti-Cyt C.
En alíquotes de teixit cardíac es valorava la capacitat respiratòria mitocondrial en una analitzador XF96 de Seahorse.
En altres alíquotes de teixit cardíac es quantificava el contingut de mitocondris amb el marcador MTDR.
Com que les variables segueixen una distribució Gaussiana, els resultats es presenten com a mitjanes ± desviació estàndard. El test t de Student era utilitzat en les comparacions entre dos grups. En les comparacions entre els quatre grups es fa servir una ANOVA.
La fracció mitocondrial
Benitez-Amaro et al. aconseguiren una fracció mitocondrial de teixit cardíac de prou rendiment. Ara bé, en aquesta fracció hi ha presència de MAM. No n’hi ha ni lisosomes ni LDs. Això respon a la major intensitat de relació entre mitocondris i MAMs en el cardiomiòcit originari.
La purificació de mitocondris de cardiomiòcits compta amb la dificultat de l’abundància relativa de MAMs, el fort ancoratge mitocondrial entre miofibril·les i l’acoblament estret entre reticle endoplàsmic i mitocondris dins de la regulació de calci. Les electromicrografies d’aquest estudi corroboren aquest panorama.
Una dieta HFHC provoca l’acumulació d’esters de colesterol en mitocondris
Els conills alimentats amb una dieta HFHC presenten alteracions en l’expressió d’alguns dels gens estudiats. Per exemple, hi ha un augment de l’expressió del gen LRP1, una forta disminució de l’expressió de LDLR i una disminució parcial del gen HMG-CoA-reductasa.
No hi ha diferències entre els quatre grups de conills pel que fa al contingut de mitocondris del teixit cardíac.
En els animals alimentats amb una dieta estàndard, no hi ha detecció d’esters de colesterol en el teixit cardíac, mentre que els nivells de colesterol lliure mitocondrial són de l’ordre de 5 ng/μg de proteïna mitocondrial. Els animals alimentats amb una dieta HFCH tenen uns nivells mitocondrials d’esters de colesterol de 30 ng/μg de proteïna, i de colesterol lliure de l’ordre de 23 ng/μg. En canvi, tant amb una dieta com en l’altra són semblants els nivells mitocondrials de triglicèrids, cosa remarcable, ja que la dieta HFHC és rica en greix.
Les elecromicrografies indiquen que els conills amb una dieta HFHC tenen mitocondris de cardiomiòcits amb una estructura de cristes tubulars, mentre que els conills que reberen una dieta estàndard tenien una estructura típica de cristes lamel·lars. Una altra alteració induïda per la dieta HFHC era una major vacuolització i inflament de mitocondris cardíacs.
Els anticossos anti-P3 inhibeixen l’acumulació d’esters de colesterol en mitocondris
La immunització amb P3 comporta que els conills comencin a sintetitzar anticossos anti-P3. Aquests animals, quan són alimentats amb una dieta HFHC, resisteixen l’acumulació d’esters de colesterol en els mitocondris cardíacs. Val a dir que això no afecta els nivells de colesterol lliure dels mitocondris, ni tampoc els nivells de triglicèrids.
La immunització amb P3 també protegeix l’estructura dels mitocondris cardíacs front la dieta HFHC.
La immunització amb P3 promou les interaccions de mitocondris amb gotes lipídiques.
La immunització amb P3 de conills alimentats amb HFHC fa que les gotes lipídiques dels cardiomiòcits siguin més grans i més electrodenses.
Les electromicrografies mostren que hi ha dos tipus d’interacció entre mitocondris i LD:
– una interacció lateral amb contacte més extensiu.
– una interacció apical, que contacte més limitat.
La immunització amb P3 promou una interacció més intensa entre mitocondris i LDs en el context d’una alimentació HFHC.
La immunització amb P3 protegeix l’activitat mitocondrial sota una dieta rica en colesterol
Els cors de conills alimentats amb una dieta HFHC mostren una reducció de la ratio d’activitat entre els complexos I i IV de la cadena respiratòria mitocondrial. També hi ha una caiguda de l’activitat del complex II.
La immunització amb P3 protegeix d’aquest efecte de la dieta HFHC sobre la ratio CII/CIV. No obstant, no és capaç de revertir la caiguda de la ratio CI/CIV. Benitez-Amaro et al. pensen que això es deu a que el complex I es veu afectat més per l’acumulació de colesterol lliure que no pas d’esters de colesterol. Els anticossos anti-P3 protegeixen el cardiomiòcit de l’entrada d’esters de colesterol, però no poden fer res contra l’entrada de colesterol lliure.
La perspectiva d’una immunoteràpia anti-LRP1 en la malaltia metabòlica
Benitez-Amaro et al. mostren que unes lipoproteïnes enriquides en ester de colesterol comporten en el conill una acumulació d’esters de colesterol en els mitocondris de cardiomiòcits, produint-hi alteracions morfològiques i bioenergètiques. La immunització prèvia dels conills amb el pèptid P3 de la LRP1 protegeix contra l’alteració de l’arquitectura mitocondrial i contra la caiguda de l’activitat del complex II.
Això indicaria que la immunoteràpia basada en la LRP1 podria ser útil en la prevenció de la disfunció mitocondrial cardíaca associada a la hipercolesterolèmia.
El receptor de les LDL en els cardiomiòcits és el LDLR, que mitjança l’entrada d’esters de colesterol al compartiment endolisosomal. La LRP1 facilitaria l’assimilació pel cardiomiòcit d’esters de colesterol de lipoproteïnes com les LDL agregades per un mecanisme alternatiu. Aquest mecanisme requereix la interacció entre LRP1 i l’ApoB100.
Benitez-Amaro et al. consideren necessaris estudis addicionals amb microscòpia d’alta resolució per entendre com els esters de colesterol de la dieta acaben arribant als mitocondris, i com això provoca alteracions morfològiques i funcionals.
En l’actualitat el grup de Llorente-Cortés ja disposa d’anticossos monoclonals anti-P3, i tenen la intenció de comprovar-ne l’efectivitat en un model de fallida cardíaca.
Lligams:
– LRP1 immunotherapy enhances cardiomyocyte respiration by restricting cholesteryl ester accumulation in mitochondria. A. Benitez-Amaro, E. Garcia, M.T. LaChica Lhoëst, A. Polishchuk, I. Zegri-Reiriz, D. Vilades, J.M. Guerra, L. Fernández-del-Rio, S. Mirabet, V. Samouillan, O. Shirihai, M. Liesa, C. Enrich, V. Llorente-Cortés. Journal of Lipid Research 66: 100783 (2025).
Des de la Mediterrània 