Una de les activitats principals de Markus Fisher com a director de l’Escola de Ciència dels Aliments i de l’Institut de Química Alimentària d’Hamburg és el desenvolupament i aplicació de tècniques d’autentificació de matèries primeres alimentàries. L’aproximació òmica, és a dir l’estudi simultani del conjunt de gens (genoma) o de metabòlits (metaboloma), hi té molt a dir. Johannes Brockelt, del grup de recerca de Fisher, treballa en el desenvolupament d’una tècnica metabolòmica no-dirigida, concretament lipidòmica, per comprovar l’origen geogràfic declarat de partides de maduixes. És justament en un article publicat avui a la revista Molecular Omics on Brockelt et al. ho expliquen. La tria de les maduixes (Fragaria x ananassa) es justifica pel fet de tractar-se d’una fruita amb un mercat global, i que per això mateix declarar-ne l’origen geogràfic és un factor de marketing, especialment en la idea de ‘producte de proximitat’. Són les diferències de preu entre països les que animen el mercat mundial de la maduixa, i posar-hi una etiqueta falsa quant a l’origen pot ajudar a comercialitzar-les millor. Les mesures clàssiques de traçabilitat necessiten el suport de mètodes analítics que siguin inequívocs. Brockelt et al. utilitzen una tècnica de cromatografia líquida de mobilitat iònica acoblada a espectrometria de masses per aconseguir un perfil lipídic no-dirigit de maduixes, i amb ell intenten diferenciar les maduixes cultivades a Alemanya de les importaded d’altres països. Amb una anàlisi discriminant lineal assoleixen una precisió en aquesta diferenciació del 90%. Quan intenten afinar més quant a la classificació de les maduixes segons si són de l’Europa Central (Alemanya, Països Baixos, Polònia) o de la Conca Mediterrània (Espanya, Grècia, Egipte), la precisió baixa al 74%. En aquesta discriminació participen com a marcadors rellevants un total de 39 lípids. El perfil lipídic, és clar, no depèn únicament del país d’origen, sinó que també és modulat per condicions climàtiques. Tot i amb tot, Brockelt et al. confien que la tècnica proposada pot contribuir a evitar fraus alimentaris i a confirmar l’autenticitat de les maduixes que es venen a Alemanya com a fetes a Alemanya.
Brockelt et al. proposen una tècnica no-dirigida de LC-IM-MS per fer el perfil lipídic de maduixes amb el qual demostrar-ne l’origen geogràfic.
L’origen geogràfic de les maduixes
Aquesta recerca fou concebuda per Brockelt i Fischer. Brockelt contribuí a la metodologia, el programari, la validació, l’anàlisi formal i la investigació. Fischer hi aportà recursos. Les dades foren tractades per Brockelt, qui va fer el primer esborrany de l’article. Felix Schmauder i Marina Creydt, revisaren i editaren aquest esborrany. Els gràfics foren elaborats per Brockelt. Fischer supervisà el projecte, que fou administrat per Fischer i Creydt. Es tracta del IGF Project (01IF22909N). Els autors agraeixen les aportacions fetes per Christian Ahlers, Lina Cvancar, Kim Brettschneider i Soeren Wenck.
L’article fou tramès a la revista Molecular Omics el 5 de gener. Després d’un procés de revisió, l’article fou acceptat l’11 de maig.
L’origen geogràfic dels aliments és un factor que de manera creixent adopten els consumidors en les decisions de compra. De fet, segons la normativa europea (EC Nº 1169/2011), en alguns casos l’origen geogràfic de l’aliment ha de formar part obligatòriament de l’etiquetatge.
Aquesta tendència contrasta amb la globalització creixent dels mercats alimentaris. La maduixa és un bon exemple de fruita que té un comerç àmpliament mundial. A Alemanya hi ha 2000 granges que cultiven maduixes, l’àrea destinada a aquest cultiu puja a 140 km2, i la producció anual ronda 1.300.000 tones. Prenent dades del 2023, les importacions de maduixa fresca a Alemanya pujaren a 114.010 tones: 71.700 tones d’Espanya, 16.900 tones de Grècia, 13.000 tones dels Països Baixos i 2.200 tones d’Egipte.
El preu mitjà de les maduixes alemanyes a Alemanya fou en el 2023 de 3,35 € el quilogram. Les maduixes importades a Alemanya tenien un preu mitjà que, segons el país d’origen, se situava entre 1,36 i 2,46 € el quilogram. Aquest diferencial de preu s’explica en part perquè a Alemanya els costos laborals i de producció són superiors, però també perquè les cadenes de subministrament són més curtes i perquè hom prioritza la qualitat d’ésser fresques i de proximitat. Una bona part de la maduixa alemanya es ven sota etiquetes de qualitat regional.
En aquest context hi ha un incentiu econòmic per al frau en l’etiquetatge, és a dir per fer passar maduixes d’importació com a maduixes de proximitat. Eufemísticament, hom en diu ‘re-declaració d’origen’. Som davant d’una situació que requereix disposar de mètodes analítics d’autentificació.
El metaboloma és el conjunt de metabòlits d’un organisme. En les darreres dècades hom ha fet propostes metabolòmiques d’autentificació de l’origen geogràfic de les maduixes:
– perfil elemental: és la tècnica més clàssica, consistent en avaluar-ne el contingut d’elements químics. Amb les tècniques ICP-MS i AAS és possible aconseguir-ne el perfil elemental i les ratios d’isòtops estables. Les condicions ambientals en les que s’han cultivat les maduixes influeixen en aquests perfils i ratios.
– compostos volàtils, mesurats per cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses (GC-MS). El perfil de compostos volàtils depèn de factors genotípics (cultivars) i de l’ambient de cultiu.
– tanins, mesurats per LC-MS. El perfil de tanins reflecteix factors geogràfics i ambientals.
– compostos fenòlics, mesurats per LC-MS/MS. El perfil fenòlic reflecteix l’origen regional.
– la combinació de mesures físico-químiques (pH, contingut de sucre, etc.) pot aplicar-se a una anàlisi multivariada per fer una discriminació de l’origen regional.
– el perfil de compostos aromàtics per GC-MS i d’àcids fenòlics per HPLC pot ser distintiu de l’origen geogràfic de la maduixa.
Un perfil metabolòmic ha de considerar el caràcter global del mercat de la maduixa, tant en termes de països d’origen com de cultivars. També ha de considerar la variabilitat interanual i estacional. El grup de recerca de Fischer ha treballat en l’aplicació de l’espectroscòpia d’infraroig proper amb transformació de Fourier (FT-NIR) per a la discriminació de maduixes alemanyes i no-alemanyes, assolint precisions del 92%. El problema del perfil de FT-IR és que no ofereix informació detallada dels metabòlits concrets que fonamenten aquesta discriminació.
En la distinció de l’origen geogràfic d’espàrrecs hi contribueixen tant metabòlits polars (hidròfils) com apolars (hidròfobs o lipòfils). Ara bé, els marcadors més rellevants tendeixen a ésser molècules apolars, és a dir a fer part del ‘lipidoma’. És per això que Brockelt et al. optaren per una aproximació lipidòmica.
Com que un dels objectius d’aquesta recerca és identificar marcadors metabòlics concrets d’origen geogràfic, és millor utilitza una estratègia no-dirigida, és a dir enfocada a tot el conjunt de metabòlits lipídics. Com a tècnica han seleccionat la cromatografia líquida acoblada a l’espectrometria de masses de temps de vol per quadrupol de mobilitat iònica per ionització d’electrosprai (LC-ESI-IM-qTOF). D’ací deriva un perfil lipídic que ha de permetre classificar maduixes segons si són alemanyes o no. En segona instància, el mètode ha de permetre classificar-les en funció de sis són d’Alemanya, de Polònia, dels Països Baixos, d’Espanya, de Grècia o d’Egipte.
Tècniques estatístiques multivariades permeten comparar les intensitats relatives dels pics lipídics de les cromatografies. Mitjançant MS/MS es poden identificar els metabòlits rellevants en la discriminació geogràfica, aprofitant una cèl·lula de mobilitat iònica (IM) per determinar-hi el valor de secció transversal de col·lisió (CCS). Els valors CCS permeten separar isòmers, isòbars i conformacions, cosa útil en una matriu tan complexa com els extractes apolars de maduixes.
Amb la identificació de marcadors és possible bastir una tècnica rutinària LC-ESI-QqQ-MS/MS enfocada a fer una predicció sòlida de l’origen geogràfic de maduixes.
La metodologia lipidòmica
Els reactius utilitzats procedien de Merck KGaA (isopropanol), de Carl Roth GmbH and Co (cloroform, metanol, acetonitril i format d’amoni) i d’Agilent (purina, hexakis(1H,1H,3H-tetrafluoropropoxi)fosfazina, hexametoxifosfazina). L’aigua desmineralitzada era ultrapurificada amb un sistema Milipore.
En total s’utilitzaren 195 mostres de maduixes. La selecció mostral cercava un equilibri pel que fa als països d’origen: Alemanya, Polònia, Països Baixos, Grècia, Egipte i Espanya. De cada mostra s’anotava també l’any de collita i la varietat.
Les mostres alemanyes eren recollides directament del camp i es guardaven en refrigeració fins a l’anàlisi. En cada cas es prenien 500 grams de maduixes de diferents fileres i plantes.
Les mostres no-alemanyes eren adquirides d’importadors alemanys o, si era possible, directament de distribuïdors locals de Grècia, Egipte, Espanya, Polònia i els Països Baixos.
Les mostres foren recollides entre el 2022 i el 2024. Factors com la disponibilitat, l’estacionalitat i la logística local hi influïren. Així d’Egipte només es prengueren mostres d’un mateix any, mentre que d’Alemanya es prengueren mostres dels tres anys esmentats.
En arribar al laboratori, la mostra (500 grams) era rentada amb aigua desmineralitzada. Cada maduixa era quartejada amb un ganivet ceràmic, descartant-ne el peduncle. Els quarts de maduixa eren congelats en nitrogen líquid (−196 °C) i conservats a −20 °C.
Una alíquota congelada de 300 grams era homogeneïtzada amb la mateixa quantitat de neu carbònica en un molí de ganivetes de Retsch. La pols congelada resultant era assecada en fred i conservada a −80 °C.
L’extracció pel mètode de Bligh i Dyer es feia a partir de 50,0 ± 0,5 mg de pols de maduixa dipositava en tubs eppendorf de 2 mL, sobre els que s’afegia 0,75 mL de cloroform/metanol (1:2, v/v) refredat amb gel. També s’hi dipositaven dues boles d’acer de 3,25 mm, per tal de fer-les anar en un molí de boles Bead Ruptor 24. Després era el torn d’afegir-hi 0,5 mL d’aigua i 0,25 mL de cloroform, i tornar a passar els tubs pel molí de boles. Després d’una centrifugació se’n recuperava el sobrenedant, que era diluït 1:4 amb cloroform, i centrifugat de nou.
El perfil lipídic es feia amb un sistema 6560 Ion Mobility qToF LC-MS d’Agilent. La fase mòbil consistia en aigua, acetonitril, isopropanol i format d’amoni. L’anàlisi MS contemplava un rang de masses de 50 a 1700 Da. La purina i la fosfazina feien de calibradors de masses.
Els arxius de dades IM-TOF eren processats informàticament i transferits al programa MetaboAnalyst 6.0.
Es considerava el país d’origen com a factor, i hom disposava de sis possibles països. De les 1523 variables LC-IM-MS, n’hi havia 379 que presentaven diferències significatives entre grups de països. S’hi aplicava una anàlisi de components principals, seguida després d’una anàlisi discriminant lineal.
La diferenciació entre maduixes alemanyes i no-alemanyes
Els primers 48 extractes apolars de maduixes de la seqüència de mesura foren utilitzats per generar una mostra de control de qualitat.
L’anàlisi de components principals fou aplicada a les mesures de 195 mostres de maduixes i a 22 mesures fetes amb la mostra de control de qualitat. Aquesta anàlisi confirmà la constància de la mostra de control.
Seguidament, l’anàlisi de components principals fou aplicada a les 1523 variables lipidòmiques de les 195 mostres de maduixes. Hom distingia entre les mostres d’Alemanya i les mostres de fora d’Alemanya (Països Baixos, Espanya, Grècia i Egipte). En aquesta anàlisi de components principals, els dos components principals PC1 i PC2 suposen el 14,8% de la variança total. Amb PC1 i PC2 no és possible fer una separació clara entre les maduixes alemanyes i les no-alemanyes. Quan hom empra els components PC2 i PC5, que suposen plegats un 9,5% de la variança, comença a haver-hi una separació entre maduixes alemanyes i no-alemanyes: les primeres tenen una puntuació PC2 negativa i les segones una de PC2 positiva.
Amb una anàlisi de discriminant lineal (LDA) feta amb una validació creuada quíntuple i 100 repeticions s’aconsegueix la classificació correcta del 96,4% de les mostres no-alemanyes i del 77,7% de les mostres alemanyes, reflectint una especificitat del 90,0%.
La diferenciació de maduixes quant al país d’origen
L’anàlisi de components principals fou aplicada a les 195 mostres de maduixes. Amb PC1 i PC2 no és possible separar els sis països, per bé que les maduixes espanyoles i gregues tenen un valor PC2 positiu que contrasta amb el negatiu de PC2 de les de Països Baixos, Polònia i Alemanya. Les maduixes egípcies queden en el mig.
Amb PC2 i PC5 es poden distingir millor les maduixes del nord (Països Baixos, Polònia i Alemanya), pel seu valor negatiu en PC2.
Amb una LDA, la predicció per país d’origen assoleix una precisió del 74,2% ± 6,1%. Aquest valor baix s’explica per la dificultat de destriar entre Alemanya, Països Baixos i Polònia, que comparteixen temperatures més fresques i precipitacions més abundant durant el període de maduració de les maduixes. També són similars els climes de Huelva i de Pyrgos, així com la pràctica del regadiu.
També hem de recordar que les mostres analitzades es corresponen a 34 varietats diferents. La PCA i LDA per varietat mostra una precisió de classificació del 50,7% de mitjana.
La identificació dels metabòlits discriminants més rellevants
Hi ha 379 variables lipidòmiques influïdes per l’origen geogràfic de les maduixes. L’anàlisi d’espectres MS/MS i de valors CCS permet destriar entre aquestes variables unes 45 que en serien les més importants.
D’aquestes 45 variables, n’hi ha 23 que es corresponen a fosfatidilcolines (PC). Considerant els adductes, això es tradueix a 19 PCs.
De les 45 variables, n’hi ha 17 de triacilglicèrids (TGs), que descomptant adductes, es correspondrien a 15 TGs.
Finalment, 5 de les 45 variables són diacilglicèrids (DGs).
Entre tots aquests marcadors lipídics d’origen geogràfic podem distingir:
1) un grup de marcadors de països de clima temperat, com ara TG 18:0_18:3_22:0, TG 18:0_18:2_22:0 i DG 18:1_18:2. Es tracta d’èsters d’àcid estearidònic (18:1), àcid linoleic (18:2) o linolènic (18:3). Aquests àcids grassos mono- o poliinsaturats són més habituals en plantes de regions fredes, ja que ajuden a mantindre la fluïdesa de la membrana cel·lular en baixes temperatures.
2) un grup de marcadors de països de clima càlid. Es tracta de molècules amb menys insaturacions. Hom podria explicar-ho com un mecanisme de protecció front a l’estrès lipoperoxidatiu induït per temperatures més elevades.
L’aplicació pràctica de la lipidòmica en la certificació d’origen de maduixes
Brockelt et al. consideren necessari ampliar el nombre de mostres analitzades amb aquesta tècnica, considerant-hi més països. Però ja seria possible aplicar la tècnica amb la finalitat de distingir les maduixes alemanyes de les importacions de països més càlids.
Lligams:
– Lipid profiling: proving the geographical origin of strawberries (Fragaria × ananassa) using a non-targeted LC-IM-MS approach. Johannes Brockelt, Felix Schmauder, Marina Creydta, Markus Fischer. Mol. Omics (2025).
Des de la Mediterrània 