El virus del Nil Occidental (WNV) és un arbovirus, en el sentit que es transmès per un artròpode, típicament un mosquit. Dins del grup dels ortoflavivirus que poden produir encefalitis en humans és el més difós. A més, també pot produir encefalitis i altres símptomes neurològics severs en cavalls. És considerat una amenaça emergent tant en el context de la medicina humana com de la veterinària equina. El grup de recerca de la veterinària Imen Larbi, cap del Laboratori de Microbiologia Veterinària de l’Institut Pasteur de Tunis, ha fet un estudi retrospectiu sobre 25 mostres equines recollides entre el 2018 i el 2023 on hi havia sospites d’infecció per WNV. Presenten els resultats obtinguts en un report al Virology Journal, amb Chaima Badr com a primera autora. Les 25 mostres estudiades consisteixen en teixit cerebral i sang recollida de cavalls diagnosticats clínicament o presumptament morts com a conseqüència de la infecció per WNV en diverses localitats de Tunísia. En 11 de les 25 mostres trobaren la presència del gen WNV NS2A detectable per qRT-PCR. En aquestes 11 mostres aconseguiren l’aïllament del virus WNV en un cultiu de cèl·lules Vero, i la seqüenciació parcial del gen E (que codifica per a la glicoproteïna de l’embolcall víric). L’anàlisi filogenètica d’aquestes seqüències indicava que tots els 11 isolats pertanyien al llinatge WNV 1a, i que eren estretament relacionats entre ells, conformant un grup diferenciat dins del subtipus mediterrani del clade 1a. Es caracteritzaven per la presència de la seqüència NYS (Asn-Tyr-Ser) en la posició 154-156 de la proteïna E, que podria ésser un lloc potencial de N-glicosilació. Al mateix temps, no presentaven les mutacions E-I159V o E-I159A. Tot plegat indica la circulació de WNV en diverses regions de Tunísia. Badr et al. alerten que una monitorització del WNV en la cabana equina és essencial, ja que les infeccions en cavalls solen precedir brots d’infecció per WNV en humans.
PhD Dre obtingué aquesta electromicrografia de partícules del virus del Nil Occidental el 20 de novembre del 2007
El virus del Nil Occidental (WNV)
El WNV és un Flavivirus. Diem que és un virus zoonòtic, perquè pot infectar cavalls a més d’ésser humans. Diem que és un arbovirus perquè és un virus transmès per artròpodes: concretament és transmès per la picada de mosquits. Diem que és un virus encefalític perquè pot provocar símptomes neurològics severs. Dintre del llistat d’arbovirus encefalítics, WNV ocupa el primer lloc en termes de distribució mundial. El nom de ‘Nil Occidental’ fa referència a la localitat on fou descrit en primer terme en el 1937, en el districte de ‘West Nile’, Uganda.
WNV és un virus d’ARN, és a dir que el seu genoma consisteix en una molècula d’àcid ribonucleic. Aquest genoma té una longitud de vora 11 mil parells de nucleòtids (=11 kb). Diem que és un virus RNA de sentit positiu [=ARN(+)] perquè la seqüència de la cadena genòmica és directament traduïble en els ribosomes de l’hoste a proteïnes. Efectivament, el genoma de WNV codifica per una poliproteïna que és processada donant lloc a:
– tres proteïnes estructurals, la de la càpside (C), la de la membrana (M) i la de l’embolcall (E).
– set proteïnes no-estructurals (NS).
Aquestes 10 proteïnes són essencials per a la replicació del genoma viral.
En la natura el WNV circula essencialment en un cicle de transmissió d’ocell a mosquit, i de mosquit a ocell. Els ocells més habitualment infectats són passeriformes. Els mosquits més habitualment infectats són del gènere Culex. Podem dir que els ocells són l’hoste amplificador, perquè és en els ocells que hi ha una major producció vírica. En canvi, diem que els mosquits són vectors perquè en el cicle juguen un paper essencialment de transmissió indirecta d’ocell a ocell.
Cavalls i humans poden ésser infectats pel WNV per la picada d’un mosquit prèviament contagiat del reservori en ocells. Ara bé, cavalls i humans són un hoste final per al WNV, ja que aquests ja no són infectius per a mosquits degut a la insuficient virèmia que hi generen. Cavalls i humans, doncs, són un hoste inapropiat per al WNV. En la majoria de casos la infecció equina per WNV és asimptomàtica, però entre un 1% i un 10% dels casos evoluciona cap a una malaltia neurològica, amb una taxa de mortalitat del 33%.
Hom ha identificat en el WNV un total de nou llinatges (WNV-1, …, WNV-9). Els llinatges que circulen a Àfrica són WNV-1, WNV-2 i WNV-8. WNV-1 i WNV-2 són els llinatges més escampats i més patogènics. Tant l’un com l’altre han estat causants de brots neuroinvasius. WNV-1 és considerat un virus epidèmic global. WNV-2 és un llinatge emergent a Europa des del 2004 on ha provocat diversos brots, els més greus en el 2018.
Bé sigui com a virus endèmic o com a virus epidèmic, WNV és present a Àfrica, Europa, Àsia i Amèrica. En el 2023 es reportaren a Europa 707 casos humans d’infecció per WNV (67 d’ells mortals), 152 casos equins i 247 brots en aus. A Àfrica el WNV-1 ha estat detectat a Algèria, a la República Central Africana, a Egipte, a Costa d’Ivori, a Kènia, al Marroc, a Tunísia, a Senegal i a Sud-Àfrica.
En el 1996 es registraren al Marroc casos d’encefalitis equina per WNV. A Líbia, en el 2022. A Algèria, en el 2023. A Tunísia els casos equins registrats de WNV remunten als anys 1980, i hi ha hagut brots en el 2005, 2006, 2008 i 2013. S’han registrat a Tunísia brots neuroinvasius en humans en el 1997, 2003, 2012, 2018 i 2023.
Un programa de vigilància passiva d’abast nacional
Badr et al. presenten dades recopilades en el marc dels primers sis anys (2018-2023) d’un programa de vigilància passiva d’abast nacional en poblacions equines, que té com a objectiu la identificació d’agents etiològics associats amb malalties neurològiques, febres i morts sobtades no-explicades.
S’hi han analitzat 25 mostres, 19 de teixit cerebral i 6 de sang, recollides especialment al nord i al centre de Tunísia. Les mostres foren recollides de cavalls morts que havien tingut símptomes com ara malalties del sistema nerviós central: ensopegada, paraplegia, atàxia, debilitat general, tremolor i paràlisi parcial o completa. La presa de mostres la realitzava personal del departament veterinari. En 19 cavalls es prengué el cervell sencer en el marc de la necròpsia. De cada encèfal es prenien mostres de teixit cerebral i cerebel·lar, així com del tronc de l’encèfal i de la zona cervical de la medul·la espinal. Les mostres d’òrgans i de sang es recollien en criotubs, i s’emmagatzemaven a -80°C/-20°C en arribar al laboratori.
En aquestes mostres es feia inicialment un test del virus de la ràbia. No s’hi va trobar en cap d’elles. Seguidament es feia un test del WNV, del virus Usutu (USUV) i de l’herpesvirus equí 1 (EHV1).
De les mostres es feien paral·lelament extraccions d’ARN total i d’ADN total. Sobre aquests extractes d’àcids nucleics es feien amplificacions per PCR en temps real de:
– el gen NS2A de WNV.
– el gen NS5 d’USUV.
– el gen gB d’EHV1.
En cap de les 25 mostres es detectà presència d’USUV o d’EHV1. En 11 de les 25 mostres (44%) es detectà la presència de WNV.
L’aïllament del virus es realitzava en cèl·lules Vero (ATCC CCL-81) que es feien créixer en plaques de 24 pous fins a la confluència. Llavors se’ls inoculava sobrenedant cerebral. Eren incubades seguidament durant una setmana, comprovant-hi la presència d’efectes citopàtics cada dia. Al cap dels 5-7 dies es prenien mostres de sobrenedant d’aquest primer pas (P1), que era inoculat a altres cultius Vero. Així s’obtenia un segon passatge (P2) i encara un tercer (P3).
S’obtingueren així 11 isolats de WNV. Mitjançant RT-PCR estudiaren el gen E d’aquests isolats. Els amplicons eren seqüenciats en un ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer. La recerca en bases de dades identificà un total de 79 seqüències de WNV de Tunísia. Les 11 seqüències afegides a GenBank foren PQ215111, PQ215112, PQ215113, PQ215114, PQ215115, PQ215116, PQ215117, PQ215110, PQ219713, PQ219714 i PQ493387.
El WNV a Tunísia
De les 25 mostres analitzades, 11 foren positives per rRT-PCR de NS2A de WNV. En aquestes 11 mostres s’aconseguí l’aïllament del WNV en cultiu de cèl·lules Vero. En aquest cultiu es podien constatar efectes citopàtics en forma de focus típics de cèl·lules infectades que es desprenien del substrat.
Pels 11 isolats de WNV s’aconseguiren amplicons del gen E per RT-PCR niuada. Dels 11 isolats, 3 provenien de Tunis, 2 de Manouba i 1 d’Ariana, corresponents a mostres preses entre el 2020 i el 2023. Una altra soca provenia de Nabeul, collida el 2019. Una altra de Jendouba (2018). Dues venien de Kasserine (2019 i 2020), i una de Sidi Bouzid (2020).
L’anàlisi filogenètica del gen E indicava que els 11 isolats pertanyen a WNV llinatge 1 clade a. Concretament queden agrupats en un clúster diferenciat dins del subtipus mediterrani d’aquest clade. Són clarament diferents de l’isolat de WNV recuperat el 1997 d’un cas humà: aquest isolat és més proper a la seqüència reportada als Estats Units en el 1999. Entre les 11 variants la identitat nucleotídica és del 99-100%, mentre que la identitat amb la mostra humana tunisina del 1997 és de tan sols el 94%.
Els 11 isolats de WNV analitzats són estretament relacionats (98%) amb soques italianes recuperades el 2021-2022 de mostres de mosquits Culex, ocells, cavalls i humans. També hi ha similituds (98%) amb soques recuperades de Senegal (2013-2018), Marroc (1996 i 2003), la soca francesa Aleka (2015). Més distant (94-96%) és la relació amb soques del subtipus mediterrani més antigues (2000-2009) recuperades d’Itàlia, Espanya, França o Portugal.
El patró filogenètica indica l’existència d’un fort vincle filogeogràfic entre les soques tunisianes de WNV i les soques recents que circulen a la Conca Mediterrània i a l’Àfrica Occidental.
El gen E és altament conservat en WNV-1a. Cinc isolats tunisians (WNV/353/18, WNV/187/19, WNV/749/22, WNV/259/23 i WNV/136/23) mostren proteïnes E glicosilades. L’anàlisi de seqüència indicaria un lloc de N-glicosilació a la posició aminoacídica 154-156 (Asn-Tyr-Ser). Les mostres tunisianes no presenten les mutacions E-I59V o E-I159A.
El paper de la vigilància virogenòmica
Badr et al. expliquen que el seu estudi constitueix el primer aïllament i caracterització molecular de WNV en mostres equines de Tunísia. Estudis previs havien reportat únicament una serologia positiva, indicativa d’exposició a WNV. Aquests estudis havien detectat, amb anticossos específics, la presència de WNV en cavalls i mosquits del nord de Tunísia.
El WNV que circularia en cavalls a Tunísia en el període analitzat (2018-2023) seria de llinatge 1 clade a. WNV-1a ja havia estat detectat a Tunísia en casos humans neuroinvasius (1997-2023) i en el mosquit Culex pipiens (2014). WNV-1a ha estat detectat recentment a Europa i Àfrica en brots que afecten mosquits, ocells i humans. WNV-1 i WNV-2 serien els llinatges més rellevants per l’impacte neurològic en poblacions humanes.
La relativa homogeneïtat genètica dels isolats de WNV en cavalls tunisians podria respondre a una introducció directa o a una font comuna d’infecció. Badr et al. pensen que l’origen cal trobar-lo o bé en aus migratòries o bé en la dispersió mitjançada pels mosquits vectorials. Tunísia, al capdavall, es troba en una de les rutes migratòries d’ocells entre Àfrica i Europa. Ara bé, el WNV també podria ésser endèmic a alguns governorats de Tunísia, amb transmissió i amplificació locals: les condicions bioclimàtiques de Tunísia poden sostindre gran poblacions de mosquits. Badr et al. consideren necessaris estudis específics sobre la dinàmica epidemiològica local del WNV. El concepte ‘una sola salut’ és clau, perquè el WNV circula entre mosquits i ocells, des d’on infecta cavalls i humans.
Badr et al. remarquen que cap de les soques isolades deixi de presentar isoleucina en la posició 159 de la proteïna E. La mutació I159V (valina per isoleucina) s’associa a una major neurovirulència, major replicació viral i infiltració de limfòcits T en el cervell. La seqüència Asn-Tyr-Ser en posició 154-156 indicaria una possible N-glicosilació: aquest tret molecular és un favor virulència en flavivirus, amb major capacitat de replicació en cèl·lules de mosquit, d’au i de mamífer.
Badr et al. consideren que la caracterització genòmica completa (WGS) ajudaria a una anàlisi filogenètica més fina. Fins ara això a Tunísia només s’ha fet amb la soca isolada del cas humà de WNV del 1997. Caldria posar atenció en els casos humans de WNV que es reportaren al sud-est i a l’oest de Tunísia en el 2023. De tota manera, cal considerar els cavalls com una espècie sentinella per al WNV.
Lligams:
– First report of West Nile virus infections in horses in Tunisia from 2018 to 2023. Chaima Badr, Mariem Handous, Jihene Nsiri, Imen ElBehi, Marwa Arbi, Abderrazak Maaroufi, Mohamed Ali Bennour, Raja Ben Osman, Khalil Dachraoui, Mondher Abbes, Anis Mahmoudi, Ines Khosrof, Soufiene Abrougui, Jihene Lachheb, Elyes Zhioua & Imen Larbi. Virology Journal 22: 318 (2025).
Des de la Mediterrània 