L’anomenat eix intestí-cerebral (GBA en l’acrònim anglès) es manifesta, entre d’altres coses, en la influència que el microbioma digestiu exerceix sobre el comportament de l’hoste. De tota manera, l’eix intestí-cerebral és en realitat una xarxa bidireccional de vies de senyalització. El grup de recerca en ecologia marina de Josep Alós Crespí, de l’Institut Mediterrani d’Estudis Avançats (IMEDEA, CSIC-UIB) d’Esporles ha investigat com la variabilitat en el microbioma explica la variabilitat de comportament en l’orada (Sparus aurata). Aina Pons Salom és la primera autora d’un article publicat a la revista Royal Society Open Science en el que presenten els resultats de tests comportamentuals estandarditzats realitzats en 67 juvenils d’orades, 30 dels quals salvatges i 37 de piscifactoria. Els eixos comportamentuals estudiats són la fermesa, l’agressivitat, la sociabilitat, l’activitat i l’exploració. Mostres intestinals servien per analitzar la diversitat, composició i estructura del microbioma a través de la seqüenciació del gen 16S rRNA. Pons Salom et al. troben correlacions significatives entre tipus comportamentuals i característiques microbiòmiques. Hi ha diferències entre els resultats de juvenils salvatges i de granja. Aquestes associacions conviden a fer més recerca sobre els mecanismes subjacents. Alhora, el coneixement d’aquestes associacions pot traslladar-se a la gestió tant de poblacions silvestres d’orada com d’aqüicultura.
Un grup d’orades By Georges Jansoone (JoJan) – – Fotografia pròpia, CC BY 3.0, Link
Comportament i microbioma
Aina Pons Salom (IMEDEA) participà en la concepció, cura de dades, anàlisi formal, investigació, metodologia, administració de projecte, recursos, programari, supervisió, validació, visualització, redacció i edició. Eneko Aspillaga (IMEDEA) participà en el tractament de dades, anàlisi formal, redacció i edició. Ignacio A. Catalán (IMEDEA) participà en la concepció, investigació, metodologia, supervisió, redacció i edició. Tomeu Viver (IMEDEA) participà en la concepció, tractament de dades, anàlisi formal, investigació, metodologia, supervisió, redacció i edició. Marco Signaroli (IMEDEA) participà en la concepció, tractament de dades, investigació, metodologia, programari, redacció i edició. Javien Sanllehi (IMEDEA) participà en la concepció, investigació, metodologia, redacció i edició. Amalia Grau (LIMIA-IRFAP) participà en la concepció, investigació, metodologia, administració de projecte, supervisió, redacció i edició. Martina Martorell-Barceló participà en la concepció, investigació, metodologia, redacció i edició. Margarida Barceló-Serra (IMEDEA) participà en la redacció i edició. Josep Alós (IMEDEA) participa en la concepció, tractament de dades, anàlisi formal, adquisició de fons, investigació, metodologia, administració de projecte, recursos, programari, supervisió, validació, visualització, redacció i edició.
La recerca es finança amb el projecte FISHOBES (CTM2017-91490-EXP) del Ministeri espanyol de Ciència i Innovació. Pons Salom tenia una beca predoctoral (FPI/2269/2019) del Govern Balear. Aspillaga comptava amb una beca postdoctoral Vicenç Mut (PD/041/2021) del Govern Balear. Signaroli tenia una beca predoctoral del Ministeri. Alós tenia el suport dels projectes CLOCKS I+D+I i METARAOR, finançats pel FEDER.
Els autors agraeixen la tasca dels anglers voluntaris i de la Marina de Porto Cristo en la captura dels individus salvatges. També agraeixen a Dolors Furones i Magda Monllaó (IRTA) per fornir els individus de granja. Tenen paraules d’agraïment per a l’equip del LIMIA.
Dins d’una mateixa espècie es poden descriure diferents tipus comportamentuals quan les diferències individuals de comportament són prou consistents en el temps i en diferents contextos ecològics. L’etologia es fixa habitualment en cinc grans eixos:
– agressivitat.
– activitat.
– sociabilitat.
– exploració-evitació.
– fermesa.
Aquests eixos etològics es modulen al llarg de la vida de l’organisme. No s’escapa la rellevància que poden adquirir en la supervivència i la reproducció. Els tipus comportamentuals són parcialment heretables, ja que són sota l’influx de factors genètiques, epigenètics, ambientals i experiencials.
Entre els factors ambientals no hem de comptar exclusivament en l’ambient extern, sinó també en un aspecte intern: el microbioma. El microbioma és el conjunt de microorganismes comensals que habiten en les diferents compartiments corporals. El més ben estudiat és el microbioma o flora intestinal, un dels temes més clàssics de l’ecologia microbiana.
La microbiota intestinal és conformada per la comunitat de microorganismes que habiten el tracte gastrointestinal. El terme microbioma intestinal sol fer referència específicament als genomes d’aquests microorganismes. Una part important d’aquest microbioma és el bacterioma intestinal, és a dir el conjunt de genomes bacterians que es poden trobar en el tracte digestiu.
Dins de la microbiota intestinal hi ha dos components ecològics:
– la fracció de microbiota al·lòctona o transitòria, que és conformada essencialment per microorganismes de vida lliure. La seva presència en el tracte digestiu s’associa amb el contingut intestinal, processat des de l’aliment fins a la femta.
– la fracció de microbiota autòctona o estable. Viu sobretot adherida a la mucosa intestinal.
Dins de la microbiota autòctona es pot diferenciar encara un ‘nucli’, conformat per la porció del microbioma intestinal que és present en la majoria d’hostes d’una població. Aquest ‘nucli’ pot exercir importants funcions biològiques per a l’hoste. En tots els vertebrats el microbioma intestinal juga un paper crucial en la fisiologia, la salut i el comportament. Per exemple, la comunitat bacteriana intestinal pot influir en el metabolisme de neurotransmissors com la serotonina, la dopamina i la noradrenalina. Metabòlits o compostos microbians poden ésser assimilats pel sistema circulatori, arribar al sistema nerviós central i allà modular la funció cerebral i el comportament. Per això es parla de l’eix intestinal-cerebral, que és una connexió complexa i bidireccional, en la qual participen el nervi vague, el sistema immunitari o el sistema endocrí.
Tests comportamentuals estandarditzats
Els protocols experimentals en animals foren aprovats i autoritzats pel Comitè Ètic d’Experimentació Animal de la Universitat de les Illes Balears (CEEA 98/07/18) i el Comitè Ètic de Recerca Animal de la Conselleria d’Agricultura, Pesca i Alimentació i de la Direcció General de Pesca i Medi Marí del Govern Balear, seguint la normativa espanyola (RD53/2013) i europea (2010/63/UE).
Pons Salom et al. han realitzat tests comportamentuals estandarditzats en el Laboratori d’Investigacions Marines i Aqüicultura (LIMIA-IRFAP) del Port d’Andratx. S’hi establiren 12 arenes comportamentuals.
La mostra de peixos salvatges consistí en 30 juvenils d’orades, amb una mida corporal mitjana de 12,38 ± 1,12 cm i un pes de 29,35 ± 6,99 g. Aquests peixos foren capturats en una badia somera i tancada de Mallorca, amb pesca amb ham i línia, entre el març i l’abril del 2019. Després de la captura els peixos eren transportats en un tanc oxigenat de 50 L al LIMIA-IRFAP. En arribar al laboratori eren transferits a les arenes comportamentuals.
La mostra de peixos de granja fou fornida per l’Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA) el juliol del 2019. Dos-cents individus del mateix programa de cria foren transportats al LIMIA-IRFAP i col·locats en dos tancs d’aqüicultura de 1000 L. Els peixos eren alimentats amb pinso convencional (D-2 Optibream AE 1P, Skretting). En l’inici de l’experiment cada peix era col·locat en arenes comportamentuals. Dels 200 individus foren seleccionats aleatòriament 37 (12,8 ± 1,06 cm de longitud i 30,2 ± 7,89 g de pes).
Així en l’estudi participaren 67 individus, 30 de salvatges i 37 de criats. El període de puntuació comportamentual anà de l’11 de març al 23 d’abril del 2019 en el cas dels 30 peixos salvatges; i del 19 de juliol al 22 d’agost del mateix any en el cas dels 37 peixos de granja.
Cada arena comportamentual consistia en un aquari de 120 L d’aigua marina, amb un llit de sorra i un refugi. Darrera de cada tanc s’establí una estació de buidatge amb una bomba d’aigua, un escalfador d’aigua i un airejador de pedra. La temperatura de l’aigua era de 20,9 ± 0,91°C. El sistema de filtratge incloïa dues esponges de diferent gruix, un sistema de filtració biològica i una escumadora proteica per retirar-hi compostos orgànics. L’aigua marina era recirculada amb un sistema tancat purificat per ultraviolat. El sistema d’il·luminació consistia en una pantalla LED situada al damunt de l’arena, controlada per fer-hi un cicle 12:12 h de llum/foscor.
Els peixos eren introduïts en l’area comportamentual en un període de 7 dies. Els peixos salvatges rebien tres gambes diàries. Els peixos de granja rebia 1 g de pellet diaris. Els primers tres dies eren el període d’aclimatació. Els 4 dies posteriors eren els d’experimentació.
En els quatre dies d’experimentació, les arenes comportamentuals eren gravades en vídeo contínuament. Les dades comportamentuals eren extretes per revisió manual i per una anàlisi automàtica.
Cadascun dels cinc experiments era repetit diàriament durant els 4 dies. Cada test tenia una durada d’una hora, excepte el test d’activitat, que era de 2 hores.
L’activitat era descrita com l’activitat de moviment general de l’individu en un entorn familiar i segur, d’acord amb el test de camp obert. Això es feia al matí, abans dels altres tests.
La sociabilitat es definia com la reacció individual a la presència de co-específics. Un individu de mida semblant era col·locat en un petit aquari al costat de l’arena comportamentual. Es mesurava el temps total esmerçat en un radi de 6 cm del centroide de l’altre co-específic.
L’exploració es definia com la reacció individual a una nova situació. Això consistia en la introducció d’una figureta zoomorfa de joguina de color.
L’agressivitat es definia com la reacció comportamentual agonista envers co-específics. Es feia amb el test del mirall.
La fermesa es definia com la resposta a una situació arriscada. Això es feia amb la introducció d’unes pinses d’aquari en l’arena durant 5 segons. Seguidament s’hi deixava caure aliment, i es mesurava el temps que trigava el peix a alimentar-s’hi.
L’ordre en el qual es realitzaven els tests d’exploració, agressivitat i sociabilitat era aleatoritzat cada dia. El test de fermesa era el darrera de la seqüència, ja que s’havia de fer després d’alimentar el peix.
Un model mixt lineal generalitzat (GLMM) era emprat per analitzar les dades comportamentuals. Cada individu era classificat en els eixos següents:
– ferm vs. tímid.
– agressiu vs. no-agressiu.
– actiu vs. no-actiu.
– social vs. no-social.
– exploratori vs. no-exploratori.
En el darrer dia dels tests comportamentuals, els individus eren sacrificats amb una sobredosi de MS-222. Es recollien en condicions estèrils els tractes gastrointestinals. S’hi feia posteriorment una extracció d’ADN, una amplificació del gen 16S rRNA, la seqüenciació de l’amplicó i el processament bioinformàtic de la seqüència. El microbioma ‘nucli’ era definit com les unitats filogenètiques (OPUs) presents en el 80% dels animals.
La diversitat del microbioma era avaluada amb tres mètriques:
– el nombre d’OPUs per cada individu, corresponent al nombre d’espècies o riquesa.
– l’índex de Shannon, de diversitat.
– l’índex de Simpson.
La composició del microbioma
En total s’obtingueren dels 67 individus 6.618.979 seqüències d’alta qualitat del gen 16S rRNA, corresponents a 1656 OPUs. De la mostra de 30 individus salvatges s’obtingueren 695 OPUs, i de la mostra de 37 individus de granja 935 OPUs.
De la mostra de juvenils salvatges, el phylum bacterià més present eren els Proteobacteria (68%), seguits de Firmicutes (15%), Actinobacteriota (9%) i Bacteroidota (3%). L’OPU més abundant era Ralstonia sp. 1 (28%).
De la mostra de juvenils de granja, el phylum bacterià més present eren els Firmicutes (77%), seguit dels Proteobacteria (17%). Les OPUs més abundants es corresponien a Lactobacillus (70%).
El microbioma nucli era de 8 OPUs en la mostra salvatge i de 7 OPUs en la mostra de granja. Tan sols hi ha una espècie compartida entre els dos grups: Streptococcus sp. 1.
És patent la diferència en composició del microbioma dels juvenils salvatges i de granja.
Microbioma i comportament
El microbioma nucli no mostra associacions significatives amb els eixos comportamentuals. Tampoc no ho fan ni l’índex de Shannon ni el de Simpson. Ni tampoc la mida corporal o la setmana experimentals.
El microbioma no-nucli, en canvi, sí mostrava associacions significatives amb els eixos comportamentuals. Hi havia associacions comportamentuals amb el nombre d’espècies del microbioma. Els peixos amb un microbioma més divers tendien a ésser més actius i exploradors, alhora que més ferms.
Hi ha OPUs que són més abundants en individus actius: Acidovorax, Methylorubrum, Sphingomonas.
Hi ha OPUs que són més abundants en individus no-actius: Cutibacterium.
Streptococcus és més abundant en individus ferms. Lactobacillus aviarius és més abundant en individus tímids.
Hi ha una relació entre la mida corporal i la composició de microbioma no-nucli en individus salvatges, que no s’observa en canvi en individus de granja.
Tipus comportamentual i comunitat microbiana
Hi ha múltiples associacions entre la diversitat, composició i estructura del microbioma intestinal i els tipus comportamentuals en juvenils d’orada.
Les diferències entre el microbioma intestinal de juvenils salvatges i de granja s’explica per les condicions de criança. L’ambient, les interaccions social i l’alimentació són diferents.
Ralstonia mannitolillyica és l’espècie més abundant del microbioma intestinal dels juvenils salvatges. Estudis previs en orades han mostrat que aquest bacteri té efectes beneficiosos per a l’hoste.
El gènere Lactobacillus és el més abundant en el microbioma intestinal dels juvenils de granja. Això s’explicaria pel pinso amb el que se’ls alimenta en piscifactoria, on els lactobacils són vistos com a probiòtics.
Que els individus més actius i més exploradors tinguin un microbioma més divers pot obeir a diferents raons. Per exemple, pot ésser el cas que els individus més actius i exploradors tinguin una major exposició a ambients diferents, i això impliqui l’entrada al microbioma de microorganismes més diversos.
Pons Salom et al. consideren per a una recerca futura fer estudis longitudinals, on es prenen dades de comportament i de microbioma intestinal al llarg del desenvolupament ontogènic. El problema és poden aconseguir mostres intestinals rellevants de manera no-invasiva.
El coneixement de la relació entre microbioma i comportament és especialment rellevant en aqüicultura pel que fa al disseny de protocols d’intervenció amb un ventall més ampli de probiòtics.
Lligams:
– Behavioural types correlate with the gut microbiome in juvenile wild and reared gilthead seabream. Aina Pons Salom, Eneko Aspillaga, Ignacio A. Catalán, Tomeu Viver, Marco Signaroli, Javier Sanllehi, Amalia Grau, Martina Martorell-Barceló, Margarida Barcelo-Serra, Josep Alós. R. Soc. Open Sci. 12: 250100 (2025).
Des de la Mediterrània 