Un mètode d’extracció d’ARN d’alta qualitat per a larves pluteus de garota (Genètica mediterrània, 7/2017)

Paracentrotus lividus és l’espècie de garota o eriçó de mar de consum més habitual a Catalunya. És una espècie de distribució atlanto-mediterrània, que habita en fondàries no superiors a 20 metres, bé damunt de les roques o en praderies de Zostera o Posidonia. Això l’adult, és clar, ja que les larves fan part del zooplàncton. Fou amb aquesta espècie i amb altres de similars que hom investigà els secrets de l’embriologia. Des de llavors, P. lividus ha estat una espècie model en recerca biològica, alhora que hom l’ha estudiada també per la seva rellevància en els ecosistemes litorals mediterranis. Potser per això resulta sorprenent que encara hom no disposi del genoma complet anotat d’aquesta espècie. De totes maneres, es fan esforços per desenvolupar tècniques que permetin ampliar el coneixement de les bases moleculars dels processos ontogènics d’aquesta espècie. Un exemple d’això és la selecció d’un mètode d’extracció d’ARN d’alta qualitat aplicable a larves pluteus i altres estadis embrionaris de P. lividus per part d’un grup d’investigadors napolitans. Nadia Ruocco et al. el presenten en un article a PLoS Biology.

Dibuix d’una larva equinopluteus. El cicle de vida de “Paracentrotus lividus” té una durada de 2-3 anys fins a l’assoliment de la maduresa sexual.

Un mètode d’extracció d’ARN de larves equinopluteus amb qualitat suficient per als mètodes de seqüenciació de nova generació

Paracentrotus lividus és un model experimental d’elecció en biologia del desenvolupament. El seu genoma és relativament simple en no haver patit duplicacions, la qual cosa facilita l’anàlisi funcional de gens. Això ajuda a la caracterització de les vies de senyalització implicades en els processos de desenvolupament.

Aplicar en aquesta tasca les tècniques de seqüenciació de nova generació obrirà encara més portes al coneixement sobre les bases moleculars d’aquests processos. En l’estadi embrionari, amb una biomassa ben limitada, és cabdal disposar de mètodes d’extracció d’ARN d’alt rendiment. Això és el que han cercat precisament Maria Costantini, del Departament de Biologia i Evolució d’Organismes Marins de l’Stazione Zoologica Anton Dohrn, de Villa Comunale (Nàpols) i Nadia Ruocco, que treballa a l’estació i al Departament de Biologia de la Universitat de Nàpols Frederic II així com a l’Institut de Química Biomolecular-CNR de Pozzuoli. L’anàlisi formal del procés anà a càrrec de Susan Costantini, de l’Istituto Nazionale Tumori “Fondazione G. Pascale”, de Nàpols. De l’Estació Zoològica també participaren Valerio Zupo, Giovanna Romano i Adrianna Ianora. El director de Ruocco a l’Institut de Química Biomolecular era Angelo Fontana.

La captura

Una garota fotografiada per Frédéric Ducarme a la Reserva Marina de Banyuls de la Marenda

Les captures submarines de garotes P. lividus es feren durant l’època de cria en un indret de públic accés de la Badia de Nàpols, respectant la legislació italiana i les directives europees de protecció animal. Els espècimens capturats, tots adults, foren traslladats en capsa tèrmica i, en menys d’una hora, ja eren a l’Estació Biològica Anton Dohrn, on eren mantinguts en tancs amb aigua marina circulant.

L’obtenció d’embrions

Les garotes així obtingudes foren injectades a través de la membrana peribucal amb una solució de clorur de potassi per tal d’estimular l’emissió de gàmetes. Els òvuls eren rentats amb aigua de mar filtrada. Els espermatozous foren concentrats, assecats i mantinguts a 4ºC fins a l’ús.

Es feren preparacions de diferents quantitats d’òvuls de cinc femelles diferents: 500 òvuls, 1000, 2500 i 5000. Aquestes preparacions foren fertilitzades amb una ratio d’espermatozous:òvuls de 100:1. A les 48 hores després de la fertilització, els embrions, ja en l’estadi pluteus, eren recuperats per centrifugació, resuspesos en un agent estabilització de la casa Qiagen, congelats amb nitrogen líquid i matinguts a -80ºC.

Cinc mètodes comercials d’extracció d’ARN

Els cinc mètodes comparats foren:
– El mètode TRIzol de la casa Invitrogen.
– El mètode GenElute de la casa Roche.
– El mètode RNeasy de la casa Qiagen.
– El mètode RNAqueous de la casa Thermofisher.
– El mètode Aurum de la casa Bio-Rad.

Quantitat i qualitat d’ARN

La quantitat d’ARN obtinguda fou mesurada per l’absorbància a 260 nm. Per valorar la qualitat es mesuraren les absorbàncies a 230 i 280 nm. Les ratios d’absorbància 260/280 i 260/230 indiquen la puresa de l’ARN en relació als contaminants més habituals (proteïnes, fenol, etc.). La integritat de l’ARN (valor RIN) es mesurà electroforèticament a partir d’una alíquota de 100-200 ng de cada mostra en un xip d’Agilent, que detecta la presència de 18S rRNA i 28S rRNA. Les ratios espectrofotomètriques i el valor RIN foren els indicadors emprats quant a la qualitat de l’extracte d’ARN.

Els resultats

Les preparacions fetes a partir d’una quantitat més elevada d’embrions (2500, 5000) generen per qualsevol dels cinc mètodes assajats una quantitat suficient d’ARN total (2-3 μg) suficient per a les tècniques de seqüenciació de nova generació. La puresa de l’ARN és obtingut és similar en tots cinc casos, amb excepció del mètode del TRIzol (l’únic no basat en una membrana de sílica). Ruocco et al. remarquen, però, la manca de correlació entre la puresa estimada pel mètode espectrofotomètric i la puresa indicada pel valor RIN. Aquesta manca de correlació podria deure’s al fet que el valor RIN depèn de l’ARN ribosòmic mentre els quocients d’absorbància depenen de l’ARN total (que és majoritàriament ARN missatger). L’ARN ribosòmic és més estable que l’ARN missatger.

Elecroforesi de l’ARN total extret dels embrions de “Paracentrotus lividus”. La distinció entre dues bandes principals corresponents a l’ARN ribosòmic 18S i 28S és la base del valor RIN.

Ruocco et al., doncs, consideren que la quantitat mínima d’embrions per fer l’extracció hauria d’ésser de 2500. El mètode més eficient per valorar la integritat de l’ARN seria el valor RIN. Segons aquest valor, els kits d’extracció més eficients serien RNeasy i Aurum.

Lligams:

High-quality RNA extraction from the sea urchin Paracentrotus lividus embryos. Nadia Ruocco, Susan Constantini, Valerio Zupo, Giovanna Romano, Adrianna Ianora, Angelo Fontana, Maria Costantini. PLoS ONE 12: e0172171 (2017).

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: