Un protocol de criopreservació de semen per al gall fer cantàbric (Veterinària mediterrània, 15/2022)

En el gall fer (Tetrao urogallus) es reconeixen tota una sèrie de subespècies. El gall fer cantàbric (Tetrao urogallus cantabricus) n’és una d’elles i es troba en perill crític. De fet, és la subespècie amb menor variabilitat genètica i la població es troba en regressió. Disposar d’un banc de semen és un element cabdal de programes de conservació. Emma O’Brien, del Departamento de Reproducción Animal del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA-CSIC), de Madrid, ha encapçalat els esforços per disposar d’un protocol de criopreservació de semen de gall fer cantàbric. En un article a Veterinary Medicine and Science, O’Brien et al. expliquen que han utilitzat el gall domèstic (Gallus gallus domesticus) com a model. Així sotmeteren semen de gall domèstic a diferents components de crioprotecció. Seleccionaren com a millor medi de preservació un que utilitzava LR84 com a extensor i dimetil-acetamida (DMA) al 4% com a crioprotector. Aquestes condicions també resultaren bones per al semen de gall fer cantàbric, però encara milloraven amb l’addició de glicerol al 8%. Més rellevant encara que el protocol concret que proposen, és el fet d’haver trobat que el semen de galls domèstics mediterranis i el semen de gall fer cantàbric responen de forma semblant a processos de congelació-descongelació.

Un protocol de congelació per a un banc de semen de gall fer cantàbric

Julián Santiago Moreno, del Grupo de Investigación en Fisiología y Tecnologías de la Reproducción en Especies Silvestre de l’INIA-CSIC, concebé aquesta recerca. També aconseguí finançar-la a través del projecte CON18-141 de Zoitechlab S.L. i INIA, que ell mateix gestiona.

En la metodologia participaren Cristina Castaño (INIA-CSIC), Adolfo Toledano-Díaz (INIA-CSIC), José Néstor Caamaño (de Selección y Reproducción Animal SERIDA del Principado de Asturias, amb seu a Xixón), Carlos Hidalgo (SERIDA), Luis Eusebio Fidalgo (del Departament d’Anatomia, Producció Animal i Ciències Clíniques Veterinàries de la Universidade de Santiago de Compostela, USC), Ana María López-Beceiro (USC), Milagros Cristina Esteso (INIA-CSIC) i Ramón Balsera (del Servicio de Vigilancia y Control de la Biodiversidad, de la Dirección General de Medio Natural, amb seu a Uviéu).

En la investigació participaren Esteso i Santiago-Moreno. L’anàlisi formal anà a càrrec d’O’Brien. O’Brien, Castaño, Toledano, López-Beceiro i Santiago-Moreno redactaren la proposta original d’article que fou després revisada per ella mateixa, per Pedro García-Casado (de Zotechlab, amb seu a Madrid), Ewa Łukaszewicz (de la Divisió de Cria d’Aviram de la Universitat de Ciències Ambientals i de la Vida de Wrocław).

Els autors tenen paraules d’agraïment per al Centro de Interpretación de Avifauna de Lugo i al Centro de Cría y Reserva Genética del Urogallo Cantábrico de Sobrescopio. Els procediments reberen l’aprovació del Comitè Ètic d’INIA, seguint la política espanyola de protecció animal RD53/2021 i la directiva comunitària 2010/63/UE.

El gall fer cantàbric (Tetrao urogallus subsp. cantabricus) viu als boscos caducifolis de la Serralada Cantàbrica. En el marc de distribució del gall fer ocupa, doncs, un lloc perifèric. A més, la població és minsa, poc diversa genèticament i amb poca entrada de fluxos gènics. El risc d’extinció en el seu hàbitat nadiu és alt. Entre els motius del declivi hi ha l’augment de la densitat dels boscos i la transformació de les vores que, paradoxalment, perjudiquen el gall fer en promoure els seus predadors. El canvi climàtic i la pressió de la caça hi poden més dificultats. Segons el cens del 2019, tan sols hi hauria 292 individus repartits en una territori de 350 km2.

Arribats a aquests extrems, un programa de conservació hauria de comptar amb eines de criopreservació de semen i d’inseminació artificial, posades al servei d’una reproducció assistida ex situ amb reintroduccions ulteriors.

El grup de recerca de Łukaszewicz ha treballat en aquest sentit en poblacions de gall fer de l’Europa central. A mitjan de la dècada passada reportaren dos mètodes de criopreservació de semen: 1) amb EK com extensor i DMA al 6% com a crioprotector en pellets i 2) amb dimetil-formamida (DMF) al 6% com a crioprotector en palles. El segon mètode aconseguia una major taxa de supervivència i de motilitat.

O’Brien et al. pensaren utilitzar una espècie model de la mateixa família dels fasiànids, el gall domèstic (Gallus gallus domesticus), atenent al reduït nombre d’individus de gall fer cantàbric.

El desenvolupament del protocol

Per al desenvolupament del protocol s’utilitzaren cinc galls domèstics de Birchen Leonesa, dos galls fers europeus i set galls fers cantàbrics. Els cinc galls de Birchen Leonesa fan part del programa de conservació de recursos genètics de l’INIA-CSIC. Els galls fers vivien en centres de cria en captivitat.

La recollida de semen es feia mitjançant la tècnica de massatge dorsoabdominal. En el cas del gall fer, el semen es recollia en capil·lars de microhematòcrit.

El medi EK consisteix en 0,14 g de citrat potàssic, 0,21 g de dihidrogenfosfat de sodi, 0,98 g de hidrogenfosfat de disodi, 0,7 g de glucosa, 1,4 g de glutamat sòdic, 0,2 g de D-fructosa, 0,7 g d’inositol, 0,1 g de polivinilpirrolidona, 0,02 g de sulfat de protamina per cada 100 mL d’aigua ultrapura, fixant-se el pH a 7,80 i la pressió osmòtica a 385 mOsmol/kg.

El medi LR84 consisteix en 1,92 g de glutamat sòdic, 0,8 g de glucosa, 0,08 g d’acetat de magnesi tetrahidratat, 0,5 g d’acetat de potassi, 0,3 g de polivinilpirrolidona per cada 100 mL d’aigua ultrapura, fixant-se el pH a 7,08 i la pressió osmòtica a 343 mOsm/kg.

La concentració d’espermatozoides s’estimava al microscopi en una cambra de Neubauer. La qualitat de motilitat de mostres fresques era valorada subjectivament a una escala de 0-5, on 0 és gens de moviment, 1 són moviments de cua sense progressió, 2 són moviments únicament circulars, 3 són moviments progressius però no rectilinis, 4 són moviments rectilinis però no vigorosos i 5 són moviments progressius, rectilinis i vigorosos. Paral·lelament s’hi feia una anàlisi objectiva assistida per computadora (CASA) (de la casa SCA, de Barcelona, amb programari de Microptic S.L.).

Altres components de la qualitat del semen analitzats eren la integritat d’ADN (amb el kit “In Situ Cell Death Detection” de Roche), la integritat de membrana (amb els fluorocroms iodur de propidi i SYBR-14), la integritat morfològica (amb la tècnica de tinció nigrosina-eosina), la integritat de l’acrosoma (amb la tinció de blau d’anilina sota microscòpia de contrast de fase).

La congelació es feia en dues etapes. En la primera es baixava la temperatura de 5˚C a −35˚C a un ritme de 7˚C/min. En la segona es baixa la temperatura de −35˚C a −140˚C a un ritme de 60˚C/min, sota vapor de nitrogen per damunt d’una superfície de nitrogen líquid en un bany expandit de poliestirè. D’això en resultaven palles congelades que eren llençades després i mantingudes en nitrogen líquid a −196°C.

La descongelació es feia escalfant les palles durant 30 segons en un bany d’aigua a 5°C.

El primer experiment

S’utilitzaven dos diluents diferents amb diferents concentracions de DMA per al semen d’un gall de Birchen Leonesa. Hom comparava, doncs, l’efecte de LR84 i d’EK, així com concentracions d DMA al 4% i al 6%.

Els cinc galls de l’estudi tenien uns 2 anys d’edat. Com que el volum obtingut en deu mostres (dues per cada animal) no arribava per fer els quatre tractament, la meitat de les mostres foren diluïdes amb LR i l’altra meitat amb EK.

S’analitzava la motilitat pel sistema CASA, i la viabilitat per fluorescència (PI/SYBR14).

L’estudi pilot

S’utilitzaven en semen de gall fer les condicions de l’experiment 1. També s’estudiava l’ús de glicerol com a criopreservador.

Els quatre tractament LR84/EK i 6%/4% DMA foren analitzats en mostres de semen de tres galls fers, un de cantàbric (URS1) i dos europeus (URA1 i URA2). La motilitat era analitzada subjectivament en mostres fresques. En mostres congelades/descongelades s’analitzava la viabilitat per PI/SYBR14, la motilitat per CASA i la integritat d’ADN per TUNEL.

L’ús de glicerol com a crioprotector fou analitzat en semen de gall fer cantàbric. S’utilitzaren mostres de quatre individus (31-C, 55C, 61C i 70-C). Tan sols les mostres de 31-C i 55-C tenien prou volum per continuar l’experiment, emprant LR84 com a extensor i glicerol al 8% com a crioprotector. En aquest experiments s’avaluava en mostra fresca la motilitat subjectiva, la viabilitat per eosina/nigrosina, les morfoanormalitats espèrmiques, la integritat de l’acrosoma i la integritat de l’ADN. En mostra congelada/descongelada s’avaluava la viabilitat per PI/SYBR14 i eosina/nigrosina, la motilitat i la integritat d’ADN.

La influència del medi (LR84 i EK) i de la concentració de crioprotector (4% o 6% de DMA) fou analitzada per una ANOVA amb dos factors amb interacció.

Els resultats dels experiments

Amb l’ús de DMA al 6%, el semen de gall domèstic perdia en la congelació/descongelació en totes les variables, excepte alguns aspectes de motilitat. També hi havia pèrdues quan s’utilitzava una concentració de DMA al 4%. Les millors condicions s’assolien amb el tractament LR84-6%DMA. L’ANOVA demostrava un efecte significatiu de la interacció entre medi i concentració de crioprotector.

L’experiment amb semen de gall fer indicava que el medi LR84 afavoria més la preservació que no pas l’EK. El glicerol es demostrava com a millor criopreservador que el DMA, i aquest actuavca millor al 4% que no pas el 6%.

La perspectiva d’un banc de semen de gall fer cantàbric

Aquesta recerca mostra que el massatge dorsoabdominal amb recol·lecció de semen en un tub de microhematòcrit és viable en el gall fer sense necessitat d’utilitzar cap tranquil·litzador químic ni posar en risc la salut i benestar de l’animal. O’Brien et al. recomanen utilitzar concentracions de DMA del 4%. La millor combinació és emprar LR84 com a medi i una concentració de glicerol al 8%.

La qualitat del semen del gall fer depèn de factors individuals i, en particular, de l’edat. El volum seminal del gall fer cantàbric és en general inferior al volum seminal del gall fer europeu. Normalitzant per volum, la concentració d’espermatozoide en el gall fer cantàbric també és inferior a la del gall fer europeu. Una possible raó d’aquesta diferència seria la consanguinitat de la població de gall fer cantàbric.

La consanguinitat també podria explicar els nivells elevats de dany d’ADN que hom troba en el gall fer cantàbric (del 19% en l’individu 31-C al 28% de l’individu 55-C). No obstant, en les mostres fresques de semen de l’individu URS1 hom troba valors semblants als reportats en el gall fer europeu.

O’Brien et al. remarquen el fet que l’esperma tant del gall domèstic com del gall fer presenta respostes semblants als processos de congelació-descongelació. Això obre la porta a utilitzar galls mediterranis per al desenvolupament de protocols de congelació de semen que s’extrapolin després al gall fer. De moment, la combinació òptima seria la de medi LR84 amb una concentració de glicerol del 8%, però caldrà ampliar la mida de la mostra per aconseguir resultats consistents i comparables. Aquest, doncs, no és més que el primer pas per a desenvolupar un banc de plasma germinal d’aquesta subespècie.

Lligams:

Use of native chicken breeds (Gallus gallus domesticus) for the development of suitable methods of Cantabrian capercaillie (Tetrao urogallus cantabricus) semen cryopreservation. Emma O’Brien, Cristina Castaño, Adolfo Toledano-Díaz, José Néstor Caamaño, Carlos Hidalgo, Luis Eusebio Fidalgo, Ana María López-Beceiro, Milagros Cristina Esteso, Ramón Balsera, Pedro García-Casado, Ewa Łukaszewicz, Julián Santiago-Moreno. Vet. Med. Sci. (2022).

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: