Alberto Alberti és professor associat de medicina veterinària a la Università di Sassari. Dedicat a la recerca en papil·lomavirus d’interès veterinari, ha remarcat la dificultat de desenvolupar eines profilàctiques i diagnòstiques degut a l’escassedat d’eines biotecnològiques per manipular aquests virus in vitro. En un article a la revista Vaccine publicat aquesta setmana, amb Carla Cacciotto com a primera autora, expliquen com han aconseguit utilitzar cel·lules d’insecte per a la producció de partícules virals viables basades en el papil·lomavirus oví 3 L1 (OaPV3 L1). Així han pogut desenvolupar una tècnica d’enzimoimmunoassaig per investigar la resposta immune natural a la infecció per OaPV3. També poden utilitzar les partícules per aconseguir anticossos útils per a la detecció in situ del virus. A més, aquestes partícules poden constituir la base per al desenvolupament d’un vaccí profilàctic. La clau de la recerca és l’ús d’un sistema de baculovirus que permet la generació de partícules virals. D’una banda, les partícules virals han servit per establir un test ELISA indirecte que permet la detecció en sèrum oví d’anticossos contra l’OaPV3. D’altra banda les partícules serveixen per a la generació d’anticossos policlonals i monoclonals de diferent isotip i reactivitat. Alguns d’aquests anticossos poden permetre la detecció immunohistoquímica d’OaPV3 en mostres ovines de carcinoma de cèl·lula escamosa (SCC). El pas ara és estandarditzar eines profilàctiques i serològiques específiques de l’OaPV3. La recerca de Cacciotto et al. també pot servir per entendre millor com la interacció entre l’hoste i l’OaPV3 condueix al desenvolupament SCC en un cas d’oncogènesi vírica.
Cacciotto et al. han desenvolupat la producció de partícules basades en el virus del papil·loma oví 3 en un sistema de baculovirus. Les partícules poden aplicar-se a la generació d’anticossos en rata que després poden servir, com en la imatge, en la detecció del virus en talls histològics de carcinomes ovins
El papil·lomavirus oví 3
Aquesta recerca fou concebuda per Alberto Alberti i Marco Pittau (U. Sassari). La metodologia fou dissenyada per Martin Müller (Heidelberg) i Alberti. En la investigació participaren Carla Cacciotto, Gian Mario Dore (U. Sassari), Tiziana Cubeddu (U. Sassari), Giovanni Pietro Burrai (U. Sassari), Antonio Giovanni Anfossi (U. Sassari), Elisabetta Antuofermo (U. Sassari), Maria Vittoria Varoni (U. Sassari), Maria Piera Demontis (U. Sassari), Rosanna Zobba (U. Sassari) i Pittau. El tractament de dades fou a càrrec de Cacciotto, Dore, Cubeddu, Burrai, Antuofermo, Varoni, Demontis, Zobba i Alberti. L’anàlisi formal fou realitzat per Cacciotto, Cubeddu, Burrai, Antuofermo i Zobba. La redacció de la proposta original d’article la realitzaren Cacciotto, Müller i Alberti. L’article fou tramès a la revista Vaccines el 26 de gener del 2024. Després d’un procés de revisió conclòs el 3 de maig, l’article fou acceptat l’1 de juny i publicat el dia 4.
La recerca fou finançada amb fons de la Unió Europea Next Generation. Els autors agraeixen el suport tècnic de Petra Galmbacker.
Entre els Papillomaviridae trobem un sèrie heterogènia de petits virus sense embolcall amb un genoma circular d’ADN bicatenari d’una mida de vora 8000 parells de nucleòtids. De papil·lomavirus s’han descrit en gairebé tots el grups de vertebrats, i una part s’associa amb lesions benignes o malignes en pell i mucoses. Fa un mes parlàvem de la rellevància que té en les poblacions humanes el virus del papil·lomà humà en casos de càncer (19/2024). I què passa en altres espècies?
La base de dades Papillomavirus Episteme (PaVE) consta de 498 genomes de referència, dels quals 222 són de papil·lomavirus humans. Els altres 276 són papil·lomavirus distribuïts en 110 espècies d’animals no-humans. En general, els papil·lomavirus són específics d’espècie, però n’hi ha alguns de rang més ample, i així hom ha detectat papil·lomavirus bovins infectant animals no-bovins, i papil·lomavirus ovins que infecten bovins i porcins.
Estrictament els papil·lomavirus ovins coneguts són quatre, numerats com a OaPV1, OaPV2, OaPV3 i OaPV4. D’aquests quatre n’hi ha tres (OaPV1, OaPV2 i OaPV4) que pertanyen al gènere Deltapapillomavirus. L’altre, l’OaPV3, pertany al gènere Dyokappapapillomavirus. Mentre que les infeccions per deltapapil·lomavirus ovins solen cursar de manera asimptomàtica o generar fibropapil·lomes (lesions proliferatives benignes), l’OaPV3 s’associa amb carcinomes ovins. Així en casos ovins de carcinoma de pell de cèl·lula escamosa (cSCC), l’OaPV3 és present amb una prevalença del 65%. La prevalença d’OaPV3 en controls ovins és del 30%, de manera que hom assum que l’OaPV3 és un co-inductor d’aquest tipus de tumor maligne, en el que també hi participarien altres factors de risc com l’exposició a radiació ultraviolada.
Quan hom compara el genoma de l’OaPV3 amb el dels deltapapil·lomavirus ovins troba en el primer un motiu LXCXE en el gen E7 que és absent en els segons. Aquest motiu sembla participar en la capacitat transformadora i immortalitzadora de l’OaPV3 en cultius cel·lulars.
Diferents laboratoris han desenvolupat tests directes per al diagnòstic de la infecció per OaPV3. Hi ha també un test indirecte basat en sèrum generat per l’exposició de la proteïna E6 produïda en un sistema d’expressió en Escherichia coli. No existeix, però, un sistema de cultiu in vitro d’OaPV3 que faciliti el desenvolupament d’eines serològiques específiques que siguin útils en la recerca sobre la interacció entre l’hoste i el virus.
Una alternativa al cultiu in vitro de virus és generar partícules anàlogues en sistemes d’expressió. Entre aquests sistemes d’expressió n’hi ha, com s’ha esmentat, en E. coli, però també en llevats, en Leishmania, en cultius cel·lulars de mamífers, en cultius de cèl·lules vegetals i en cultius de cèl·lules d’insecte. La proteïna L1 de papil·lomavirus, que intervé en infeccions naturals en l’autoensamblatge de partícules virals, ajuda en aquests sistemes in vitro a generar pseudocàpsides anàlogues als virus naturals. Aquests partícules pseudovirals (VLPs en l’acrònim anglès) no contenen el genoma viral de manera que no són infectives. De fet, vaccins com Gardasil o Cervarix es basen en VLPs.
Les VLPs poden ser útils en el desenvolupament d’anticossos monoclonals i de sèrum policlonal d’aplicació diagnòstica. També es poden utilitzar les VLPs en recerques sobre la infecció viral, el cicle viral o respostes immunitàries específiques de l’hoste. A més, les VLPs poden ser interessant en el desenvolupament de vaccins però també com a eines per a la vehiculació específica de fàrmacs.
Tota la recerca que hom ha fet en VLPs de papil·lomavirus humans pot ajudar a estendre-les en papil·lomavirus d’interès veterinari. Cacciotto et al. han aconseguit la producció de VLPs basades en OaPV3 en cèl·lules d’insecte a través d’un sistema de baculovirus recombinant. Injectaren aquestes VLPs en animals de laboratori, rates, ratolins i ovelles, aconseguint sèrums policlonals i anticossos monoclonals específics. Amb aquests anticossos aconseguiren establir un protocol de diagnòstic directe d’OaPV3 per immunohistoquímica. Amb les VLPs també desenvoluparen un test d’immunoenzimoassaig ELISA per a la detecció d’anticossos anti-OaPV3, que han aplicat al seguiment d’ovelles infectades pel virus.
Metodologia
Cacciotto et al. han utilitzat el sistema MultiBac per a la producció en cèl·lules d’insecte de VLPs basades en OaPV3. El punt de partida fou el gen L1 d’OaPV3, del qual en les bases de dades hi ha versions originals (WT) i humanitzades. Aquestes dues versions foren clonades paral·lelament en el plàsmid pFBDM. Aquest plàsmid bicistrònic conté dos llocs de clonació múltiple (MCS1 i MCS2), de manera que hom pot aconseguir una transcripció doble del gen d’interès. Vectors recombinants pFBDM ja carregats amb el gen L1 foren utilitzats com a donadors per a la producció de bacmids recombinants en un sistema d’E. coli. Els bacmids eren transfectats després a cèl·lules d’insecte, les quals generaven les VLPs.
Cacciotto et al. utilitzaren l’eina ‘Optimizer’ de la Universitat Rovira i Virgili per aconseguir una versió del gen L1 d’OaPV3 optimitzada segons l’ús humà de codons. Amb dos algoritmes diferents (codó a codó o Monte Carlo) generaren les seqüències H1 i H2, que encapçalaren amb una seqüència Kozak.
Per clonar el WT d’OaPV3 L1, Cacciotto et al. empraren com a punt de partida el vector de clonació pUC19/OaPV3.
La introducció dels pFBDM recombinants en E. coli es feia per electroporació. La comprovació de clonació es feia amb una selecció per resistència a la kanamicina, la gentamicina, l’ampicil·lina i la tetraciclina. Els bacmids es generaven per transposició mitjançada per T7.
Les cèl·lules d’insecte utilitzades eren les Sf9, cultivades en monocapa en un medi TNM-FH, a una temperatura de 27 °C. Les Sf9 eren transfectades amb els bacmids recombinants. Com a control positiu utilitzaven el baculovirus HPV16. L’eficiència de transfecció era valorada amb un plàsmid #226 pIE HR, que conté un gen de la β-galactosidasa sota el control d’un promotor de baculovirus.
La propagació dels baculovirus recombinants es feia recollint el sobrenedant de cultius de Sf9 transfectases i abocant-lo a nous cultius de Sf9. El temps d’incubació de cada flascó de cèl·lules Sf9 era de 6 dies.
La producció d’OaPV3 L1 per cèl·lules Sf9 transfectades era comprovada amb una tècnica d’electroforesi en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) i per una immunotransferència Western.
Els baculovirus recombinants amb el gen L1 d’OaPV3 servien per a infectar cultius en suspensió de cèl·lules High Five™. Era d’aquestes cèl·lules que s’extreien les VLPs amb una tècnica d’ultracetrifugació.
Per visualitzar les VLPs, Cacciotto et al. utilitzaren microscòpia electrònica de transmissió.
A Sardenya s’han identificat dos ramats ovins persistentment infectats per OaPV3. D’aquests ramats se seleccionaren un total de 86 ovelles, de les quals es prengueren mostres de sang i hisops cutanis. Les mostres de sèrum i de pell eren guardades a −80 °C. Aquestes mostres de sèrum serviren per posar a provar el test ELISA basat en VLPs. Les mostres de pell serviren per fer una extracció d’ADN total i una PCR específica del gen L1 d’OaPV3.
Dues ovelles foren immunitzades subcutàniament tres vegades amb 100 μg de VLPs. Al cap de quinze dies de la tercera injecció es recolliren mostres de sang per obtindre’n sèrum.
Dues rates Wistar de l’animalari del Departament de Medicina Veterinària de la Universitat de Sassari foren immunitzades amb 10 μg de VLPs, una per via subcutània i l’altra per via intraperitoneal. Al cap de 15 dies de la tercera injecció es recollien mostres de sang per aconseguir-ne sèrum.
Aquests sèrums d’ovella i de rata foren testats per immunotransferència de western amb VLPs.
El desenvolupament de l’ELISA consistí en provar diferents dilucions de VLPs per recobrir plaques de 96 pous i diferents dilucions dels esmentats sèrums de rata i d’ovella.
Per al desenvolupament d’anticossos monoclonals foren immunitzat amb VLPs cinc ratolins BALB/c. Els ratolins eren sacrificats i se n’extreia la melsa. Els limfòcits de la melsa eren emprats per a la producció d’hibridomes, mentre que altres cèl·lules esplèniques servien de base nutricional. Aquesta experimentació es va fer al DKFZ de Heidelberg. S’aconseguiren quatre anticossos monoclonals, #GH3E, #GH1G, #GH6F, i #GH2B.
Aquests anticossos monoclonals foren assajats per immunofluorescència amb cèl·lules HeLa TK4 que expressaven els gens L1 i L2 d’OαPV3 (introduïts amb plàsmids d’expressió pGEM).
Per a la immunohistoquímica s’utilitzaven seccions histològiques de 3 μm de gruix.
L’experimentació animal fou aprovada prèviament per l’Organismo Preposto al Benessere e alla Sperimentazione Animale dell’Università degli Studi di Sassari. L’experimentació animal per a la producció d’anticossos monoclonals es va fer amb el permís A12/11, Regierungspräsidium Karlsruhe.
La generació de VLPs d’OaPV3
Es desenvoluparen tres vectors llançadores pFBDM amb còpies del gen L1 d’OaPV3. D’ací s’aconseguiren tres bacmids en DH10multiBac E. coli. La correcció d’aquests vectors es verificà amb enzims de restricció i amb seqüenciació pel mètode de Sanger.
Els bacmids serviren per a la producció de baculovirus recombinants, que foren amplificats en cèl·lules Sf9. Per la tècnica de Western es confirmà l’expressió del gen L1 en cinc dels sis clons: en fou excepció el clon 11 d’H1.
Els baculovirus recombinants serviren després per a infectar cèl·lules High Five™, de les quals s’extragueren les VLPs per ultracentrifugació. La presència de la proteïna L1 en les VLPs fou verificada per SDS-PAGE i Western en forma d’una banda de 55 kDa. L’electromicrografia de transmissió confirmà la morfologia i ensamblatge correcte de les VLPs.
La resposta humoral a la infecció per OaPV3 en ovelles
Les VLPs foren la base d’un test ELISA indirecte. Aquest test serví per a la detecció d’anticossos específics en ovelles de ramats infectats en la natura per OaPV3. De 86 animals analitzats, 54 eren seropositius per l’OaPV3. Emprant com a referència el sèrum d’una ovella infectada en el laboratori, la majoria d’ovelles del ramat tenien valors d’anticossos d’entre el 25% i el 35%, però una d’elles arribà al 85%.
De les 54 ovelles seropositives, n’hi hagué 3 per a les quals s’aconseguí amplificar el gen L1 d’OaPV3 en mostres d’hisop cutani. Hi ha una correlació entre la seroreactivitat de cada ovella i la presència de lesions SCC: en 2 de les 54 ovelles seropositives s’hi detectà cSCC.
La producció de sèrum α-OaPV3 en rates i ovelles
Les VLPs s’utilitzaren per a immunitzar dues rates i dues ovelles. Els sèrums resultant reconeixien amb eficiència la proteïna L1 d’OaPV3. També ho era el sèrum policlonal dels ratolins immunitzats.
La producció d’anticossos monoclonals
De la immunització de ratolins amb VLPs s’aconseguiren quatre clons que generaven anticossos altament reactius amb VLPs. El més efectiu era l’anticòs monoclonal #GH_2B. Els anticossos monoclonals #GH_6F i #GH_1G eren IgG 1. Els anticossos monoclonals #GH_2B i #GH_3E eren IgG 2b.
Cap dels quatre anticossos monoclonals era capaç de generar un senyal detectable en presència de VLPs en immunotransferència de Western. Sí que ho podien fer una tècnica de dot blot. Això indicaria que els quatre anticossos monoclonals reconeixen epítops conformacionals de les VLPs.
Els quatre anticossos monoclonals són capaços de reaccionar amb les VLPs expressades en cèl·lules HeLa TK4.
Detecció immunohistoquímica d’OaPV3
El sèrum policlonal de rata fou posat a prova en immunohistoquímica sobre mostres ovines de SCC. Aquest sèrum reconeixia eficientment antígens en aquestes mostres. El senyal era especialment fort en el citoplasma de perles de queratina.
Els quatre anticossos monoclonals també reaccionaven amb cèl·lules epitelials neoplàsiques de SCCs ovins. Els més reactius eren els anticossos monoclonals #GH_2B i #GH_3E.
Diagnòstic i prevenció de la infecció d’ovelles per OaPV3
En termes generals, els papil·lomavirus tenen tropisme per cèl·lules epitelials de la pell i de mucoses de vertebrats. El seu cicle vital és complex, integrant diverses fases que tenen lloc en diferents moments de la diferenciació dels queratinòcits. Aquesta és la raó biològica per la qual es fa difícil aplicar en els papil·lomavirus tècniques clàssiques d’aïllament i de cultiu en una línia cel·lular. Una alternativa és cultivar-los en rais organotípics que incloguin queratinòcits en desenvolupament. L’altra és produir-los en forma de partícules virals sense ADN, com les VLPs d’aquest estudi, o en pseudovirus.
Cacciotto et al. han mostrat en aquest estudi una elevada seroprevalença de l’OaPV3 en ramats específics de Sardenya, que contrasta amb una baixa detecció del virus per PCR. La seroprevalença alta podria deure’s a animals que han superat la infecció però retenen la seropositivitat. També és possible que la PCR negativa reflecteixi infeccions molt controlades. Cacciotto et al. disposen ara de tècniques per destriar entre aquestes dues possibilitats. També ajudarà a entendre aspectes de la infecció com la recurrència o la relació amb lesions cutànies, benignes o malignes.
Un exemple d’aquestes eines són els anticossos monoclonals i els sèrums policlonals. Fins ara hom no havia pogut aconseguir aquests elements. Les VLPs que han desenvolupat podrien conduir a un vaccí. Recordem que fou així que s’aconseguiren els actuals vaccins contra l’HPV en humans. I els anticossos monoclonals podrien donar lloc eventualment a un fàrmac antiviral.
Lligams:
– Ovine papillomavirus type 3 virus-like particle-based tools for diagnosis and detection of infection. Carla Cacciotto, Gian Mario Dore, Tiziana Cubeddu, Giovanni Pietro Burrai, Antonio Giovanni Anfossi, Elisabetta Antuofermo, Maria Vittoria Varoni, Maria Piera Demontis, Rosanna Zobba, Marco Pittau, Martin Müller, Alberto Alberti. Vaccine (2024).
Des de la Mediterrània 
Podeu escriure el vostre comentari aquí: