La variabilitat heretable dins d’una espècie és la matèria primera de l’evolució. Damunt de la diversitat genètica emergeix una diversitat morfològica, que pot conferir avantatges selectius diferenciats segons la diversitat ambiental. Dos investigadors del Centre for Plant Genetics and Breding, de Crawley, a l’Austràlia Occidental, Abdi I. Abdi i Phillip G. H. Nichols, han estudiat experimentalment aquesta relació en el trèvol subterrani (Trifolium subterraneum), una lleguminosa que fa part de pastures de la regió Mediterrània, i que ha estat introduïda al sud d’Austràlia i altres zones de clima mediterrani de l’hemisferi sud. Com a material han emprat 97 línies d’una col·lecció central que representaria vora el 80% de la diversitat genètica d’aquesta espècie, així com 28 cultivars australianes. Cultivaren aquestes 125 variants per tal d’estudiar-hi 23 marcadors quantitatius agro-morfològics i 13 trets morfològics addicionals de caràcter semi-quantitatiu. Examinaren les relacions entre aquests marcadors morfològics i 24 paràmetres climàtics i edàfics corresponents als llocs d’origen de les 97 línies investigades. Dels trets morfològics estudiats, destaquen el temps de floració, la mida de fulla, el diàmetre de pecíol durant l’hivern, l’àrea de la planta en concloure l’hivern, la longitud màxima de la tija i el contingut d’isoflavones, variables que correlacionaven amb set o més paràmetres ambientals. Així doncs, aquests trets serien el resultat de la selecció ambiental. La marca foliar, la pigmentació deguda a antocianines o la pubescència s’associen amb paràmetres de precipitació i característiques de sòl. Val a dir, que Abdi & Nichols són conscients que aquestes associacions poden implicar bé un paper adaptatiu dels gens que els controlen, o bé que aquests gens es troben lligats a gens que controlen altres trets adaptatius. En un article a PLoS One expliquen els resultats obtinguts. Remarquen la rellevància de treballar amb “col·leccions centrals”, molt més manegables que no pas col·leccions globals. Però, sobretot, insisteixen en la sèrie de trets adaptatius del trèvol subterrani, que podrien il·luminar estratègies de desenvolupament de cultivars més productives i més persistents.
Dibuix de Paul Hermann Wilhelm Taubert (1862-1897) que il·lustra el trèvol subterrani. El nom de subterrani fa referència a les tiges postrades arran de terra.
Una lleguminosa anual farratgera
Abdi Ibrahim Abdi és professor ajudant del Departament de Protecció Vegetal del Col·legi de Ciències d’Enginyeria Agrícola de la Universitat de Duhok. Fou en el marc del programa de desenvolupament de capacitat humana, que Abdi rebé un ajut del Govern Regional Kurd per poder fer un mestratge a la University of Western Australia, a Crawley.
Phillip Nichols és professor associat de la Faculty of Science i investigador del Centre for Plant Genetics and Breeding de la UWA School of Agriculture and Environment, a Crawley.
Fou en l’època que compartiren a Crawley, que Abdi i Nichols realitzaren aquesta recerca sobre la diversitat morfològica del trèvol subterrani. Nichols concebé l’estudi. Nichols treballava llavors en el Department of Primary Industries and Regional Development (DPIRD) del govern d’Austràlia Occidental, i aconseguí finançament a través del projecte ‘Pre-breeding in anual legumes’ de la Meat & Livestock Australia (MLA).
Abdi i Nichols dissenyaren la metodologia al costat de Bradley J. Wintle, membre també del centre PGB i del DPIRD. L’obtenció de dades la feren Abdi, Wintle i Parwinder Kaur, professora associada de genòmica translacional del PGB. L’anàlisi formal fou duta a terme per Abdi i William Erskine, director del PGB. La investigació la tiraven endavant Abdi i Wintle. Mentre Nichols era administrador del projecte, la supervisió anà a càrrec d’ell mateix, de Kaur i d’Erskine.
Abdi redactà el primer esborrany de l’article, que fou revisat per Nichols, Kaur i Erskine. El 25 de setembre del 2019, l’article arribà a mans de PLoS One, que encomanà l’edició a Sergio Rossi, de la Université du Québec a Chicoutimi. L’article fou acceptat el 26 de desembre, i publicat el 8 de gener.
El trèvol subterrani és una planta teròfita, és a dir que passa l’hivern tot sovint exclusivament en forma de llavors, que esperen la primavera per brotar
El trèvol subterrani és una planta lleguminosa de pastures que trobem a la Conca Mediterrània i a les regions veïnes de l’Europa atlàntica i de l’Àsia occidental. És una planta diploide, amb un genoma de vuit parells de cromosomes (2n = 16 cromosomes). Es reprodueix predominantment per auto-pol·linització.
El trèvol subterrani ha estat també introduït a les “altres Mediterrànies”, és a dir a altres regions de clima mediterrani, com Nova Zelanda, l’Austràlia del sud, Sud-àfrica, la Sud-amèrica austral, Califòrnia o el Golf de Mèxic. De tots els trèvols anuals, T. subterraneum és el més rellevant a escala global com a planta farratgera i com a cultiu de renitrificació del sòl. A Austràlia, s’hi sembren més de 29 milions d’hectàrees amb trèvol subterrani.
En total, a Austràlia hi ha registrades 53 cultivars diferents, la més antiga plantada ja a començament del segle XX. Per a la identificació de cultivars es fan servir trets com el color de les llavors, les marques de fulles, el grau d’indentació foliar, la intensitat i patró de coloració foliar deguda a les antocianines, la pigmentació de flors, la pubescència o pilositat de pecíols, peduncles, tiges i fulles, etc.
Linné ja classificava com a espècie diferenciada Trifolium subterraneum. Alguns autors hi distingeixen tres subespècies d’acord amb criteris morfològics, genètics i citogenètics: T. subterraneum subterraneum, T. subterraneum yanninicum i T. subterraneum brachycalycinum. D’altres, consideren aquestes tres subespècies com a espècies diferents. Encara d’altres, consideren que són la mateixa espècie i subespècie, i que caldria dividir aquesta espècie més aviat en varietats. Abdi et al., davant de les evidències moleculars (patrons d’isozims, cariotips i amplificació aleatòria d’ADN polimòrfic), prefereixen la divisió en les tres subespècies esmentades. T. s. subterraneum i T. s. yanninicum són més habituals en sòls moderadament acídics, mentre que T. s. brachucalycinum prefereix sòls neutres o alcalins.
La diversitat morfològica interna del trèvol subterrani explica possiblement la forta discussió sobre la classificació taxonòmica interna. Una part de la diversitat obeeix a la diversitat d’ambients on viu, com passa amb el temps de floració: una floració primerenca és necessària per adaptar-se a zones d’estius breus, mentre que una floració tardana és millor per a zones d’estius llargs. Disposar d’un pecíol llarg ajuda a superar millor l’ombra de les plantes competidores de la pastura, com també ho fa disposar fulles més grans.
Existeix també diversitat fitoquímica dins d’aquesta espècie. Això és rellevant si pensem en les varietats que tenen contingut elevat d’isoflavones actives estrogènicament (com la formononetina, la genisteïna i la biocanina A), que poden provocar problemes de fertilitat a les ovelles dels ramats que hi pasturen.
En els bancs de germoplasmes trobem més de 5.000 entrades corresponents a poblacions silvestres de trèvol subterrani. La majoria d’aquestes entrades són disponibles en el DPIRD de Perth (ara gestionat per l’Australian Pastures Genebank), però també n’hi ha en centres espanyols, alemanys, italians, nova-zelandesos, sirians, nord-americans, xilens, iranians, portuguesos i sud-australians. Això equival a més de 10.000 genotips individuals. Com que el trèvol és una planta predominantment auto-pol·linitzada, cal veure aquests genotips individuals com a línies.
Col·leccions tan vastes són de difícil gestió si hom vol fer-hi experiments paral·lels. A partir d’elles, però, es poden construir col·leccions nuclears o centrals, que representin una bona part de la diversitat genètica de la col·lecció general. En el cas del trèvol subterrani, s’ha desenvolupat una col·lecció central integrada per 97 línies diferents, que si bé no arriben a l’1% del total de línies disponibles, si que representen el 80% de la diversitat genètica. De cadascuna d’aquestes 97 línies, hom disposa dades exhaustives de la localitat originària (latitud i altitud, temperatura, règim de precipitacions, pH i textura del sòl, etc).
A més de les 97 línies salvatges, Abdi et al. també han considerat 28 cultivars australianes.
Abdi et al. avaluaren 23 trets relacionats amb la morfologia i el contingut d’isoflavones, seleccionats per la seva rellevància agronòmica. Inclogueren en l’anàlisi també 13 trets morfològics semi-quantitatius.
L’estudi perseguia conèixer la diversitat agronòmica i morfològica de la col·lecció nuclear de 97 línies, per després comparar-la amb la de les 28 cultivars australianes, i seguidament destriar les associacions entre trets específics de les línies i els paràmetres climàtics i edàfiques dels seus llocs d’origen.
Els experiments
La col·lecció nuclear del trèvol subterrani fou desenvolupada per K. Ghamkhar, R. Snowball i R. Appels. Partiren d’una col·lecció total de 10.000 línies procedents de bancs genètics. D’acord amb dades eco-geogràfiques i agro-morfològiques, feren una preselecció de 760 línies. D’aquestes 760 línies i de 20 cultivars australians extragueren ADN. Amplificaren 48 loci diferents de repeticions de seqüència simple, que cobrien els vuit cromosomes que integren el genoma haploide del trèvol subterrani. Fou així que seleccionaren 97 línies, amb les que cobrien el 80% de la diversitat genètica present en les 760 línies estudiades.
De les 97 línies, n’hi ha 95 que procedeixen de poblacions silvestres (L1-L95), mentre la L96 és la cultivar Coolamon i la L97 és la cultivar Urana. La majoria de les línies (66) són de T. s. subterraneum, mentre que les altres (31) són de T. s. brachycalycinum. Abdi et al. obtingueren els germoplasmes i les dades associades de l’Australian Trifolium Genetic Resource Centre, llavors operat pel DPIRD.
Localitats d’origen de 94 línies silvestres que integren la col·lecció central del trèvol subterrani
Abdi et al. també inclogueren en l’estudi 28 cultivars australianes, 19 de T. s. subterraneum</i< (Bindoon, Campeda, Daliak, Dalkeith, Denmark, Dinninup, Dwalganup, Geraldton, Goulburn, Izmir, Leura, Losa, Mt Barker, Narrikup, Nungarin, Rosabrook, Seaton Park, Woogenellup, York), 5 de T. s. yannicum (Gosse, Napier, Riverina, Trikkala, Yarloop) i 4 de T. s. brachycalycinum (Antas, Clare, Mintaro, Rosedale).
Les 97 línies de la col·lecció central i les 28 cultivars foren plantades a Shenton Park
Les 125 línies de trèvols subterranis foren cultivades a Shenton Park, on hi ha les instal·lacions de camp de la UWA. L’experiment seguia un disseny de fila-columna amb quatre rèpliques i cinc columnes, cadascuna de les quals contenia 100 plantes, separades per 1 mentre. Aquesta separació permetia que les plantes cresquessin sense haver de competir per llum i humitat. També es plantaren 50 plantes addicionals al costat del camp experimental amb finalitats de calibrat.
La sembra es va fer el 15 de maig del 2014. En plaques de Petri de 10 cm de diàmetre es col·locaven 50 llavors damunt d’un paper de filtre Whatman No 1 humitejat amb 3,5 mL d’aigua de l’aixeta a 15°C durant 48 hores. Els germinats eren plantats en testos de torba Jiffy 9, i col·locats en safates esterilitzades que eren introduïdes a l’hivernacle. A cada test se sembraven dos germinats, un dels quals era seleccionat aleatòriament per plantar-lo en el camp experimental. Set dies després de la sembra, els pots de torba eren amanits amb Nodulaid (una preparació de rizobis del grup C, els bacteris fixadors de nitrogen que creixen en els nòduls de les lleguminoses). Els pots de torba eren regats cada dia, i cada setmana s’hi aplicava fertilitzant soluble.
El 18 de juny es traslladaren els plançons dels pots de torba al camp experimental. El camp havia estat ruixat prèviament amb glifosat. El sòl del camp era sorrenc, amb un pH de 6,5. Just abans del transplantament, el camp havia estat adobat amb fertilitzant (6,8% P, 12,4% K, 8,3% S). El 26 d’agost s’aplicà en el camp dimetoat, per tal de controlar la presència d’àfids (Acyrthosiphon kondoi) i àcars (Halotydeus destructor). El 15 de setembre es realitzà una segona aplicació de fertilitzant. El 30 de setembre s’aplicà alfa-cipermetrina per controla la presència d’erugues (Helicoverpa punctigera). El camp fou irrigat fins el 2 de desembre.
L’11 d’agost es realitzà la primera tanda de mesures, quan les plantes eren encara en estat vegetatiu (no havien florit): s’hi mesurà el diàmetre màxim de la planta, longitud i diàmetre del pecíol més llarg i l’àrea de la fulla més gran.
El 12 de setembre es prengueren mesures d’alçada de les plantes, i una avaluació visual de la biomassa (escala 1-10). Fou aquell dia que es colliren les 50 plantes de calibrat, que foren assecades a l’estufa (40°C durant 48 h). Gràcies a aquestes plantes s’establí la relació y = 2,62x + 2,18 entre el pes sec de la planta (y) i l’estimació de biomassa (x).
Cada 3 o 4 dies, les plantes eren examinades per comprovar la data de primera floració. Dues setmanes després de la primera floració es prenien mesures de la mida de fulla, longitud i diàmetre de pecíol, triant per fer-les la fulla del primer nus florit de la tija més llarga. D’aquest nus també es prenien dades de longitud i diàmetre de peduncle, així com la longitud internodal i el diàmetre de la tija.
La planta es considerava senescent quan ja no hi havia cap teixit verd. Llavors es mesurava la longitud de la tija més llarga. La planta era llavors tallada i se n’obtenia el pes sec. Les parts subterrànies de la planta eren recuperades a mà, excavant-hi el sol fins a 2,5 cm, i fent-lo passar per un tamís. També s’extreien les llavors, i es pesaven 100 llavors de cada planta per calcular el pes mitjà.
Durant l’experiment també es prenien dades de marques foliars, de la indentació, de la coloració, etc.
Pel que fa al contingut d’isoflavones estrogèniques, Abdi et al. fan ús de les dades d’un experiment previ realitzat en el 2011, en el qual s’havien plantat amb quatre rèpliques les mateixes línies que en l’experiment del 2014. En el 2011, les llavors s’havien sembrat directament en pots de torba el 16 de maig, i s’havien trasplantat al camp el 6 de juliol. Per mesurar les isoflavones s’utilitzà una tècnica de cromatografia en capa fina sobre segments discoidals (de 6 mm de diàmetre) de fulles joves i sanes collides entre el 8 i el 31 d’agost.
Les dades climàtiques de temperatura i precipitació de les localitats d’on eren originàries les línies estudiades es recolliren de WorldClim.
L’anàlisi estatística es realitzà mitjançant anàlisis de variança sobre els 125 genotips estudiats. Es calcularen els coeficients de correlació de Pearson entre els trets agronòmics i els marcadors morfològics dels 125 genotips, mentre que per a les 94 línies amb origen geogràfic determinat es feren correlacions amb les dades locals. L’heretabilitat era calculada com el percentatge de la variança fenotípica atribuïble a la variança genotípica.
La diversitat agromorfològica del trèvol subterrani
Abdi et al. estimen d’aquesta manera l’heretabilitat en sentit ample de 23 trets agro-morfològics i isoflavònics de 125 genotips diferents de trèvol subterrani.
El trèvol subterrani d’aquests experiments florí entre 83 i 176 dies després de la sembra. El rang de variació entre la col·lecció de trèvols silvestres és de 86-176 dies, mentre que el de les cultivars és de 83-141 dies. L’heretabilitat del temps de florida és del 98%. T. s. brachycalycinum tendeix a florir més tard (entre 100 i 156 dies) que T. s. subterraneum (entre 86 i 176 dies).
A 77 dies després de la sembra, el rang de variació morfològic és considerable. El diàmetre mitjà de planta varia en un factor de 2,6, mentre que la mida de la fulla més gran ho fa en 6,8, i la longitud de pecíol en 3,2. La cultivar Daliak és la que presentava llavors les fulles més petites (1,9 cm2) i els pecíols més curts (0,83 mm).
A 110 dies després de la sembra, el rang de variació de l’alçada de la planta és de 5,7. La cultivar Gosse, amb una alçada de 15,6 cm supera a tots els altres genotips.
En la primera floració, el rang de variació de la mida foliar mitjana és de 8,5.
En la senescència, la biomassa mitjana de planta varia de 17 grams a 403 grams, mentre que la longitud de la tija més llarga varia de 10 a 146 cm, i la massa mitjana de llavors ho fa de 5,2 a 20,8 mg. Les llavors més lleugeres són de la cultivar Goulburn (4,4 mg).
El contingut d’isoflavones varia de 0,5 a 4,2% de la massa seca de la fulla. La cultivar Dalkeith és la que presenta el menor contingut d’isoflavones (0,4%).
Dels trets agro-morfològics, els que presenten una major heretabilitat són: la massa de les llavors, la longitud màxima de tija, la biomassa de les plantes madures i la quantitat d’isoflavona.
Les dades d’Abdi et al. indiquen que hi ha una considerable diferenciació entre les tres subespècies de T. subterraneum. A 77 dies després de la sembra, T. s. brachycalycinum és la més gran, amb fulles també més grans, tendència que es manté a 110 dies.
Pel que fa als trets semi-quantitatius, Abdi et al. destaquen que la marca foliar més estesa és la taca de la lluna creixent amb braços (present en el 73,2% de les línies salvatges i el 60,7% de les cultivars). La major part de les cultivars (57,1%) no mostren indentació foliar. La majoria de les línies examinades mostra una pubescència moderada. Pel que fa a les taques d’antocianines, la diversitat és considerable.
En l’anàlisi de correlacions, Abdi et al. mostren que les línies que floreixen més tard, també són les que presenten majors dimensions. Hi ha també una correlació positiva entre florir més tard i presentar un contingut més elevat de genisteïna.
Molts trets morfològics presenten correlacions entre ells, com passa amb el diàmetre de la planta, la mida de la fulla i la longitud del pecíol. Uns peduncles llargs s’associen amb fulles llargues, de pecíols llargs i gruixuts. Peduncles gruixuts s’associen amb tiges gruixudes. Hi ha una correlació també entre el diàmetre de la tija i la mida de la llavor.
El temps de floració de les línies silvestres estudiades s’associa amb la latitud i la precipitació estival de les localitats d’on són originàries. En general, el trèvols de floració més tardana són de zones amb temperatures anuals mitjanes més fredes. Les plantes originàries de zones més càlides són les que mostren un creixement més vigorós a l’inici d’hivern, i les que acaben per oferir biomasses més elevades.
Les línies que presenten un contingut més elevat de formononetina són les procedents de zones amb fluctuacions tèrmiques més acusades. La biocanina A. tendeix a ésser més elevada en línies procedents de sòls acídics.
L’adaptació d’una planta de pastures
Abdi et al. remarquen el fet que hi hagi una diversitat agromorfològica semblant entre les línies silvestres i les cultivars australianes. En general, hom pot dir que les cultivars tendeixen a florir abans, cosa que s’explica pel fet que els programes de plantació australians prefereixen les variants adaptades a ambients de baixa precipitació. Les cultivars també mostren un pecíols més llargs i gruixuts, cosa que s’explica per una selecció per sobreviure en pastures de major biomassa.
Des dels anys 1960, els programes australians s’han proposat d’afavorir les variants amb un menor contingut de formononetina, pel fet que aquesta isoflavona pot reduir la fertilitat de les ovelles que hi pasturen. Abdi et al. troben, de tota manera, que de les variants silvestres de trèvol subterrani, tan sols un 7% tindrien un efecte estrogènic elevat.
Trets com el temps de floració, el contingut d’isoflavona i la biomassa hivernal i primaveral són els més rellevants en els programes de selecció de noves cultivars de trèvol subterrani. Abdi et al. mostren que la majoria d’aquests trets tenen una elevada heretabilitat, i que hi ha una considerable diversitat entre les poblacions silvestres. El grup de Kaur treballa particularment en la identificació dels gens responsables d’aquests trets, una informació útil per fer selecció entre els descendents del creuament de genotips diferents.
Lligams:
– Morphological diversity within a core collection of subterranean clover (Trifolium subterraneum L.): Lessons in pasture adaptation from the wild. Abdi I. Abdi, Phillip G. H. Nichols, Parwinder Kaur, Bradley J. Wintle, William Erskine. PLoS ONE 15: e0223699 (2020).
Des de la Mediterrània 