Compostos fenòlics antihelmíntics de plantes halotolerants (Bioquímica mediterrània, 51/2021)

Si la setmana passada parlàvem dels nematodes formadors d’agalles com un dels maldecaps de l’agricultura mundial, aquesta ho farem en relació als nematodes gastrointestinals en la ramaderia. L’impacte dels nematodes gastrointestinals de remugants en la producció ramadera empeny a dependre massa de fàrmacs antihelmíntics, damunt de l’ús dels quals s’exerceix un control regulatori. Tot plegat condueix a la recerca d’alternatives en el món vegetal, que siguin el més efectives possibles bo i garantint la seguretat alimentària. El grup de recerca de Luísa Custodio, XtremeBio, del Centro de Ciências do Mar (CCMAR) de la Universidade do Algarve, amb seu a Faro, investiga productes naturals biològicament actius d’organismes marins i plantes halòfiles. En un article publicat aquesta setmana a Scientific Reports avaluen in vitro les propietats antihelmíntiques de nou plantes halotolerants contra nematodes gastrointestinals, i identifiquen el metabòlits secundaris bioactius potencialment involucrats en aquestes propietats. Marta Oliveira et al. elaboraren a partir de biomassa seca d’òrgans aeris d’aquestes plantes extractes en acetona(80%)/aigua. Els extractes servien per a un assaig d’inhibició de l’exfundament larval (LEIA) i per a un assaig d’inhibició d’eclosió (EHIA) sobre els nematodes Haemonchus contortus i Trichostrongylus colubriformis. Els extractes més actius en aquests assaigs eren els de llentiscle (Pistacia lentiscus), ajocagripaus (Limoniastrum monopetalum), xisca borda (Cladium mariscus) i perpètua d’arenes (Helychrisum italicum picardi). Aquests extractes, tractats o no amb polivinilpolipirrolidona (PPVP), foren caracteritzats mitjançant cromatografia líquida d’alta resolució (HPLC) acoblada a un espectròmetre de masses d’ionització en electrosprai (ESI-MSn). Sembla que polifenols eren al darrera de la inhibició de l’eclosió, però únicament darrera de part de la inhibició de l’exfundat. Més enllà dels compostos fenòlics individuals, Oliveira et al. remarquen que aquestes quatre espècies halotolerants tenen una gran potencialitat contra els nematodes gastrointestinals de remugants.

Mar Mediterrània entre llentiscle des de Sant Sebastià de sa Guarda - Llafranc//embedr.flickr.com/assets/client-code.js

Llentiscle a la vora del mar

A la recerca de compostos antihelmíntics de plantes halotolerants

Aquest estudi fou dissenyat per Marta Oliveira, Hervé Hoste i Luísa Custódio. Oliveira i Custódio són membres del CCMAR de la Universitat d’Algarve, situat al Campus de Gambelas, a Faro. Hoste és membre de la UMR 1225 de l’IHAP d’INRAE, amb seu Tolosa de Lengadoc, així com de l’ENVT de la Universitat de Tolosa.

Oliveira realitzà la col·lecció del material vegetal i elaborà els extractes. En els assaigs antihelmíntics, Oliveira comptà amb l’ajut de Caroline Sprengel Lima (del Laboratori d’Antibiòtics i Quimioterapèutics de l’IBILCE de la Universitat de l’Estat de São Paulo, amb seu a São José do Rio Preto) i Setha Ketavong (de l’UMR 1225 IHAP de l’INRAe). Eulogio J. Llorent-Martínez, del Departament de Química Física i Analítica de la Facultat de Ciències Experimentals de la Universidad de Jaén (en el Campus Las Lagunillas), realitzà l’anàlisi HPLC-ESI-MSn. Oliveira redactà el primer esborrany de l’article, que fou revisat per Hoste i Custódio. Com a autora corresponsal, Custódio trameté l’article a Scientific Reports el 8 de juny. Després d’una revisió, l’article fou acceptat el 24 de novembre i publicat el 21 de desembre.

La recerca fou finançada pel Fundació de Ciència i Tecnologia (FCT) de Portugal, el projecte bilateral PESSOA entre França i Portugal i el projecte HaloFarMs de PRIMA. Els autors tenen paraules d’agraïment per a Nicolas Fabre i Valérie Cristofolli, de la Facultat de Farmàcia de la Universitat Paul Sabatier de Tolosa III, per l’ajut en la preparació i liofilització dels extractes vegetals.

La ramaderia de remugants (bovina, ovina i caprina) té un paper cabdal en l’articulació present del sector agrícola de la Conca Mediterrània, amb 267 milions de caps en el 2019. Els nematodes gastrointestinals produeixen un impacte considerable en les explotacions extensives, tant pel que fa a la salut i benestar animals com pel que fa a la productivitat i qualitat de productes com la llet. Els nematodes gastrointestinals amb major impacte potencial a Europa en termes de morbiditat i mortalitat són Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcinta, Trichostrongylus spp i Nematodirus spp.

Microfotografia de Jeff Ellison del 2007 que mostra un ou d’‘Haemonchus contortus’, un dels nematodes gastrointestinals més patogènics per a ovelles i cabres

Des dels anys 1950 el control dels nematodes gastrointestinals en la ramaderia remugants mitjançant antihelmíntics de síntesi ha jugat, doncs, un paper rellevant en el sector. Benzimidazols, levamisol, morantel, lactones macrocícliques i monepantel són administrats repetidament, en solitari o en combinació. Aquests fàrmacs ofereixen l’avantatge d’ésser antihelmíntics d’ampli espectre, però en les darreres dècades creix la fracció de cucs resistents a algun d’aquests fàrmacs i la de multiresistents a diversos d’ells.

Davant de l’augment de resistències, hom cerca nous tractaments antihelmíntics. Hom sap que l’administració de farratge amb plantes lleguminoses com el lot corniculat (Lotus corniculatus L.), el pedunculat (Lotus pedunculatus Cav.), la sulla (Hedysarum coronarium L.) i la trepadella (Onobrychus viciifolia Scop.) té efectes antihelmíntics a través dels polifenols d’aquestes plantes. En altres plantes hom ha identificat polifenols (especialment, tanins i flavonoids) amb activitat antihelmíntica, i també altres compostos antihelmíntics com terpenoids, proteïnases i saponines.

En aquestes recerques, però, no s’han considerat prou, a parer d’Oliveira et al., les plantes tolerants a la salinitat. Aquestes plantes poden ésser considerades extremòfiles, car resisteixen una elevada exposició a la llum solar i a la radiació ultraviolada i a la sequera. Això els ha permès ocupar espais en ecosistemes mediterranis. Aquesta resistència es deu, si més no en part, a la producció i acumulació de metabòlits secundaris (flavonoids, tanins, etc.) que tenen activitats antioxidants, antiinflamatòries i d’inhibició d’enzims. El llentiscle (Pistacia lentiscus), per exemple, s’ha utilitzat com a remei per a trastorns digestius i dermatològics d’ovelles i de cabres, i com a antiparasitari.

Oliveira et al. triaren dos assaigs d’avaluació de la capacitat antihelmíntica, un sobre el procés d’eclosió de l’ou i un altre sobre l’exfundat de les larves L3. A més d’avaluar la capacitat antihelmíntica d’extracte de nou espècies de plantes halotolerants, aprofundiren en la composició fitoquímica d’aquests extractes a través de l’HPLC-ESI-MSn.

Les nou espècies de plantes analitzades per Oliveira et al.

El material vegetal analitzat

D’acord amb criteris etnofarmacològics, de contingut fenòlic i de disponibilitat, Oliveira et al. seleccionaren nou espècies: el llentiscle (Pistacia lentiscus L., de la família de les Anacardiacea), la xisca borda (Cladium mariscus (L.) Pohl, de la família de les Cyperaceae), la salsona (Inula crithmoides L., de la família de les Asteraceae), la perpètua de les arenes (Helichrysum italicum (Roth) G. Don subsp. picardi (Boiss. & Reut.) Franco, de la família de les Asteraceae), la campaneta de mar (Calystegia soldanella (L.) R. Br., de la família de les Convolculaceae), el carretó de platja (Medicago marina L. de la família de les Fabaceae), la cervina (Plantago coronopus L., de la família de les Plantaginaceae), l’ajocagripaus (Limoniastrum monopetalum (L.) Boiss., de la família de les Plumbaginaceae) i la crucianel·la (Crucianella marítima L., de la família de les Rubiaceae). Plantes d’aquestes espècies foren recollides en quatre districtes de la regió costanera de l’Algarve entre el 2017 i el 2018, previ permís de l’Instituto da Conservação da Natureza e das Florestas (ICNF). Custódio feia la identificació de l’espècie. Després de collir-les, les mostres eren conduïdes al laboratori, on les rentaven, les congelaven a -20 °C, les assecaven en un Lyoalfa 15 durant tres dies, i les trituraven en un molí Retsch PM 100. Una fracció del material recollit fou conservat en l’herbari del grup XtremeBio.

El material vegetal sec i molturat era extret en una solució aquosa del 80% d’acetona, en una relació pes:volum d’1:40, a una temperatura de 20-25 °C, durant 16 hores, i en agitació. El residu era filtrat en paper Whatman nº 4), i s’eliminava l’acetona amb un rotavapor a 40 °C. El residu obtingut, és a dir l’extracte, era assecat en congelació.

El contingut fenòlic total dels extractes era estimat espectrofotomètricament per la tècnica de Folin-Ciocalteau, utilitzant com a patró l’àcid gàl·lic.

El contingut total de flavonoids dels extractes era determinat pel mètode espectrofotomètric del clorur d’alumini. En aquest cas el patró era la quercetina.

El contingut de tanins condensats dels extractes era estimat pel mètode colorimètric DMACA-HCl. El patró utilitzat era la catequina.

Les anàlisis HPLC-ESI-MSn comptaren amb patrons interns d’àcid neoclorogènic, d’àcid clorogènic, d’àcid protocatequic, de catequina, d’àcid sinàpic, d’àcid ferúlic, de quercetina, d’apigenina i de kaempferol.

Els assaigs antihelmíntics

Els ous i les larves L3 de H. contortus i T. colubriformis eren obtinguts de la femta de cabres i ovelles infectades monospecíficament. Les larves L3 es mantingueren durant un mes a 4 °C en flascons de cultiu abans de l’assaig. Els ous es recollien el mateix dia de l’assaig, i s’utilitzaven en les primeres dues hores.

L’assaig d’exfundat es fa a 23 °C for 3 h, durant les quals les larves (a una concentració de 800 larves per mL) són exposades als extractes dissolts en un tampó fosfat-salí. Seguidament, les larves són examinades per comptar-ne la proporció de les que s’han enfundat a diferents intervals (0, 20, 40 i 60 minuts). Una alíquota de cada experiment era sotmesa a una solució d’hipoclorit sòdic i de clorur sòdic per induir-ne artificialment l’exfundat.

L’assaig d’eclosió es feia en una placa de micropous, amb un densitat de 100 ous per micropous. Eren exposats a diferents concentracions d’extracte (de 78 a 5000 μg/mL). L’assaig es feia a 27 °C durant 48 hores a les fosques. Amb microscopi es feia un recompte dels ous sense eclosionar i de les larves ja eclosionades.

En alguns dels assaigs antihelmíntics es feia ús de la polivinilpolipirrolidona (PVPP). La PVPP s’uneix a tanins i flavonoids, retirant-los de la solució. Així doncs, els assaigs amb PVPP servien per destriar l’efecte dels polifenols en l’activitat antihelmíntica.

El contingut fenòlic de les plantes iniciades

El contingut fenòlic de les espècies analitzades anava de 14,2 a 226,3 mg d’equivalents d’àcid gàl·lic/gram d’extracte sec. El contingut de flavonoids era de 13,3 a 45,5 mg d’equivalents de quercetina/gram. Pel que fa al tanins condensats, tan sols hi havia nivells detectables en P. lentiscus, L. monopetalum i C. mariscus.

L’activitat antihelmíntica dels extractes

L’extracte del llentiscle era el més actiu per inhibir l’exfundat de les larves L3 i també per inhibir l’eclosió dels ous. Totes dues espècies són afectades de la mateixa manera.

Les quatre espècies que mostraven la major activitat antihelmíntica eren, en aquest ordre, P. lentiscus, L. monopetalum, C. mariscus i H. italicum picardi. Resultats menys prometedors són oferts per Calystegia soldanella, C. maritima, M. marina i I. crithmoides.

Les dades semblen indicar que l’activitat antihelmíntica s’explica pels compostos fenòlics. Així doncs, el PVPP és capaç de restaurar la capacitat d’eclosió dels ous en presència dels extractes.

Els compostos fenòlics més prometedors

En l’extracte de llentiscle els glicòsids de flavonoids (miricetina i quercetina) són els constituents principals, juntament amb àcid gal·loil-quínic i di-O-gal·loilquínic.

En l’extracte de H. italicum picardi ocupen un lloc rellevant l’àcid cafeoilquínic i l’àcid dicafeoilquínic, seguits d’O-glucòsids de quercetina.

L’extracte de C. mariscus és constituït principalment per flavan-3-ols (epigal·locatequina i catequina), proantocianidines, luteolina, C-glucosil-luteolina, glucòsid de kaempferol i apigenina.

En l’extracte de L. monopetalum destaquen l’epigal·locatequina, el sulfat d’isoramnetina, el pinoresinol i dues oxilipines.

Oliveira et al. consideren que les plantes tolerants a la salinitat poden constituir un reservori poc explorat de compostos antihelmíntics. Davant hi ha la feina d’aclarir si aquests compostos són efectius en solitari, o si cal aprofitar efectes sinèrgics. També ajudaria esclarir la relació entre l’estructura química d’un compost i la seva activitat antihelmíntica, així com el mecanisme concret d’acció. Tot plegat, sense oblidar el potencial nutricèutic i fitoterapèutic dels mateixos extractes vegetals.

Lligams:

Disclosing the bioactive metabolites involved in the in vitro anthelmintic effects of salt-tolerant plants through a combined approach using PVPP and HPLC-ESI-MSn. Marta Oliveira, Caroline Sprengel Lima, Setha Ketavong, Eulogio J. Llorent-Martínez, Hervé Hoste, Luísa Custódio. Sci. Rep. 11: 24303 (2021).

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: