Leishmania infantum és agent causal de la leishmaniosi humana en formes viscerals, cutànies o mucoses i de la leishmaniosi canina. Aquest protozou es transmet per mosquits flebòtoms del subgènere Larroussius. De fet, des del punt de mira humà, el gos és el principal reservori domèstic de L. infantum, de manera que el control i la prevenció de la leishmaniosi canina ajuda a reduir el risc d’infecció per a la població humana. Ara bé en aquest esquema també cal comptar amb els reservoris salvatges, tant d’entorns silvestres com antropitzats. La catedràtica de Parasitologia de la Universidad de Granada, Joaquina Martín Sánchez, ha liderat una recerca sobre la prevalença de L. infantum en conills salvatges de la província, que apareixia ahir com a comunicació breu a la revista Zoonoses and Public Health. El seu grup de recerca s’ha interessat en els darrers anys en el rol dels reservoris salvatges en la leishmaniosi i volia amb aquesta investigació entendre millor la dinàmica de transmissió de Leishmania infantum. De 314 conills salvatges investigats, han trobat 270 infectats per L. infantum. Això suposa una prevalença mitjana del 86,0%, que pot oscil·lar segons la comarca entre el 18,2% i la prevalença absoluta del 100%. La càrrega parasitària estimada és de 324,8 paràsits per mil·ligram de lòbul d’orella (amb un interval de confiança del 95% de 95,3 a 554,3 paràstits/mg). La càrrega màxima observada és de 91.597 paràsits/mg de teixit. Martín-Sánchez et al. troben una correlació positiva entre la càrrega parasitària en la pell de conills salvatges i la incidència humana de leishmaniosi. A més, en conills i en humans hom troba la presència dels mateixos genotips de L. infantum. L. infantum presenta una notable variabilitat genotípica en conills salvatges: la majoria d’aquests genotips també s’han trobat en mostres humanes, canines i de mosquits flebòtoms de la província de Granada. Martín-Sánchez et al. pensen que la vigilància molecular de L. infantum s’hauria de basar en el genotipatge directe en teixits infectats i no tant en cultius de laboratori. Per tot plegat pensen que els conills salvatges poden constituir un reservori eficient de L. infantum.
//embedr.flickr.com/assets/client-code.js
La leishmaniosi
Tots els autors són de la Universidad de Granada. Martín Sánchez és catedràtica del Departamento de Parasitología de la Facultad de Farmacia. Victoriano Díaz Sáez és professor contractat doctor indefinit del mateix departament. Francisco Morillas Márquez és catedràtic del mateix departament. Victoriano Corpas López, doctor en Farmàcia, és col·laborador del mateix departament. Patricia Ibáñez de Haro és investigadora contractada amb càrrec a projecte en el mateix departament. Andrés Torres Llamas és doctorand al mateix departament. Manuel Morales Yuste és professor contractat doctor indefinit del mateix departament.
La recerca es finançà amb projectes del Ministerio de Ciencia e Innovación (MICIU/AEI/10.1339/50110011033) i del FEDER (PID2022-142230NB.100), així com amb finançament de la pròpia Universidad de Granada.
L’article fou tramès a la revista el 15 de gener del 2024. Després d’una revisió conclosa el 4 d’abril, l’article fou acceptat el dia 20, i publicat el primer de maig.
L. infantum és agent causal de la leishmaniosi visceral, cutània i mucosa en la població humana i la població canina de la Conca Mediterrània. El vector més habitual són les femelles dels dípters psicòdids del subgènere Larroussius. Com que aquestes mosques piquen un ample ventall d’espècies de mamífers per alimentar-se’n de la sang, la connexió entre els reservoris humans i caní és fluida. De fet per a la població humana els gossos són el principal reservori domèstic. La incidència de leishmaniosi és especialment elevada en alguns indrets de la Conca Mediterrània, i en aquestes zones semblen jugar un paper altres reservoris domèstics i també reservoris salvatges. Els reservoris salvatges no tan sols serien rellevants en àrees selvàtiques sinó també en entorns urbanitzats. Hom ha assenyalat a poblacions silvestres de conill (Oryctolagus cuniculus) en brots epidèmics de leishmaniosi i també en zones amb una alta incidència endèmica.
Fa uns anys el grup de Martín-Sánchez trobà que no hi havia correlació entre la prevalença de leishmània en conills i la incidència de leishmaniosi canina a la província de Granada. En aquest estudi investiguen la relació a través d’un genotipatge de vigilància molecular del paràsit fonamentat en el gen K26 i en l’ADN del cinetoplast (kDNA). D’aquesta manera poden discriminar entre soques de L. infantum segons la mida de l’amplicó de K26 o segons la seqüència de kDNA.
Una recerca realitzada entre octubre i novembre del 2018 i del 2019
La recerca en conills fou realitzada els mesos d’octubre i novembre dels anys 2018 i 2019, és a dir durant períodes autoritzats de caça. El territori analitzat incloïa tot l’interior de la província de Granada (excloent-ne, doncs, la Costa Tropical, l’Alpujarra i el Valle de Lecrin). L’abundància de conills era molt variable de regió a regió.
Els conills salvatges analitzats procedien de peces abatudes per caçadores en zones de cacera autoritzada. En total s’analitzaren 314 conills. De cada conill es prenien tres seccions de teixit de l’orella de 5 x 5-mm2, és a dir que obtingueren 942 mostres en total. Cada secció era pesada.
Es feia una extracció d’ADN de les seccions cutànies. L’extracte d’ADN era avaluat qualitativament i en quantificar-lo hom feia un ajustament de concentració per deixar-la en 700 ng/μL. Una alíquota de 5 μL de l’extracte d’ADN era analitzat amb una PCR-ELISA per L. infantumi amb un GRANALEISH Multiplex qPCR.
La PCR-ELISA amplifica un fragment de 75 parells de nucleòtids de la regió variable del minicercle de kDNA de L. infantum; com que els encebadors utilitzats són marcats amb digoxigenina, la detecció dels amplicons es pot fer una microplaca recoberta d’estreptavidina i una sonda d’oligonucleòtid específic de L. infantum marcada amb biotina en el seu extrem 5’ terminal; l’ELISA utilitza un anticòs anti-digoxigenina marcat amb peroxidasa i ABTS com a substrat; la valoració es fa per espectrofotometria a 405 nm.
La GRANALEISH Multiplex qPCR, desenvolupada per aquest grup de recerca, i registrada com a marca, pot diferenciar entre L. infantum, L. tropica i L. major, alhora que ofereix una quantificació de la càrrega parasitària. La múltiplex compta amb quatre encebadors i tres sondes TaqMan específiques per a cada espècie esmentada de Leishmania. El valor de llindar de cicle (Ct) és el que permet calcular el nombre de paràsits presents a la mostra, amb l’aplicació d’una corba estàndard d’ADN de L. infantum. Es considera negatiu un valor de Ct superior a 36 cicles de PCR. S’utilitza un control positiu de 1500 paràsits que hauria de donar un Ct de 17 cicles.
Per a l’estudi de vigilància molecular parasitària, Martín-Sánchez et al. ampliquen teixits altament parasitats (≥100 paràsits per μg d’ADN) de conills salvatges, llebres ibèriques (Lepus granatensis), gossos, Phlebotomus perniciosus, humans i diversos isolats cultivats. Els encebadors aplicats van adreçats a amplificar:
– un fragment de 447 parells de nucleòtids del minicercle de kDNA (genoma mitocondrial), que és analitzat per seqüenciació.
– una regió repetitiva curta del genoma nuclear situada en el gen de la proteïna B hidrofílica acilada de superfície (gen k26), que és analitzat per mobilitat electroforètica per fer una estimació de la mida de l’amplicó.
Les seqüències de kDNA eren alineades, ajustades manualment i analitzades amb MEGA11 a través de mètodes de probabilitat màxima, parsimònia màxima i matriu de distància.
La recerca no implicava l’ús d’animals vius. Els teixits procedien d’animals caçats durant períodes autoritzats, i era el mateix caçador qui tallava l’orella de l’animal mort. El Comitè Ètic de la Universidad de Granada autoritzà la recerca en el marc del concepte d’Una Sola Salut.
Una prevalença del 86%
Dels 314 conills analitzats, 270 donaren positiu per L. infantum per les dues tècniques de PCR i per PCR-ELISA (prevalença del 86,0%). El valor era un xic inferior segons la qPCR (238 positius, és a dir prevalença del 75,8%).
Les prevalences variaven de regió a regió: Huèscar (18,2%), Baza (45,6%), Vega de Granada (74,6%), Alhama (90%), Los Montes (92%), Guadix (96,7%) i Loja (100%).
Tan sols en un 14,0% dels 314 conills salvatges analitzats donaven negatiu per a tres seccions de teixit per a les dues tècniques de PCR. De les 942 seccions d’orella analitzades donaren positiu 680 (72,2%).
La càrrega parasitària estimada per mg de lòbul d’orella anava des d’un valor de 0 (mostres negatives) fins a un màxim de 91.597 paràsits. El valor mitjà era de 324,8 paràsits per mg (amb un interval de confiança del 95% situat entre 95,3 i 554,3). Aquest valor és el triple de càrrega parasitària que el que hom pot trobar en gossos infectats.
La càrrega parasitària mitjana també variava de regió en regió. El valor més baix era a la regió de Huéscar (0,001 paràsits/mg) i el valor més alt era a la regió de Loja (1013 paràsits/mg). Huéscar, amb una baixa prevalença de L. infantum en conills salvatges, és una zona on no s’han reportat casos humans de leishmaniosi. En canvi, a Loja, amb una prevalença absoluta de L. infantum en conills salvatges, hi ha la incidència més alta de leishmaniosi humana de tota la província.
La correlació de Pearson entre la càrrega parasitària en la pell de conill i la incidència humana de leishmaniosi és de 0,791, amb un valor de p de 0,034. De fet hom pot construir un model on:
Incidència humana = 0,701 + 0,02 x Càrrega parasitària en pell de conill
En un 9,2% dels conills analitzats la càrrega parasitària superava el milió de paràsits per gram de pell. Martín-Sánchez et al. consideren aquesta càrrega com a pròpia d’individus super-difusors. A La Vega (71 conills analitzats), a Baza (11 conills analitzats) i a Huéscar (11 conills analitzats) hom no ha trobat conills superdifusors de L. infantum. A Loja (78 conills analitzats) el percentatge de conills superdifusors és del 20,5%. En gossos on la càrrega parasitària és inferior a un milió per gram de pell, la probabilitat que se n’infectin flebòtoms és molt baixa. Tot indica que la població de L. infantum se sosté fonamentalment a través d’un nombre relativament petit d’hostes altament infectats: són aquests individus els que transmeten el paràsits als flebòtoms.
L’amplificació directa de kDNA de L. infantum fou reeixida únicament en mostres de 15 conills. Els amplicons resultants foren comparats amb altres mostres (dos de teixits de llebre ibèrica, una d’un gos, dos de P. perniciosus i 13 d’humans) i amb cultius (quatre procedents de P. perniciosus, quatre d’humans i un de gos). D’aquesta manera, Martín-Sánchez et al. analitzen 42 seqüències de l’amplicó de 421 bp de kDNA. Hi troben 17 haplotips, quatre insercions/delecions i 30 posicions polimòrfiques.
En ampliar la comparació amb altres seqüències publicades de L. infantum del sud-est d’Espanya, resulten 25 haplotips. Les distàncies genètiques entre els clústers resultants van de 0,011 a 0,042. Com a grup extern utilitzen Labrus donovani. Les seqüències de conills es troben disperses entre els clústers juntament amb L. infantum que infecten humans, gossos i flebòtoms.
L’anàlisi electroforètica de 90 mostres resultà en 16 mides diferents d’amplicons de k26, que anaven de 140 a 920 bp. En les mostres procedents de conills s’identificaren 12 bandes de k26. Aquestes bandes també eren presents en les mostres procedents d’humans, gossos, llebres o flebòtoms. Els patrons de banda única eren presents en el 72,5% de les mostres de teixits, i en el 68,4% dels cultius. Les bandes més grans (540-920 bp) eren presents únicament en cultius. Aquestes discrepàncies entre mostres i cultius obeeixen, segons Martín-Sánchez et al., a una selecció artefactual de genotips en el laboratori. Per això creuen que la vigilància molecular s’hauria de fer en mostres directes de teixits.
Diversos factors poden contribuir a l’efectivitat del conill com a reservori de L. infantum: les poblacions silvestres de conill són abundants, prolífiques, gregàries, territorials i nocturnes. Amb una longevitat de 9 anys, els conills poden ser infectats per L. infantum sense patir cap manifestació negativa o tan sols d’una manera limitada. El rang de dispersió dels conills és inferior en la femella però en el mascle pot arribar a les 7 hectàrees. El biòtop favorit del conill és la llodriguera, on troba protecció i on es reprodueix, i on les femelles de mosquits flebòtoms troben la sang per completar el seu cicle vital. Les femelles de flebòtom són telmofàgiques, en el sentit que acumulen la sang de picades d’una sèrie d’individus. Si hi ha una alta densitat de L. infantum en la pell del conill, les femelles de flebòtom tenen una alta probabilitat d’infectar-se.
P. perniciosus pot ser abundant en microhàbitats domèstics, peridomèstics i selvàtics. A la telmofàgia s’hi afegeix l’oportunisme en la recerca de sang. Això permet una connexió entre el reservori salvatge (conills) i el reservori domèstic (gossos). La perspectiva d’una sola salut ajuda a connectar els aspectes mèdics, veterinaris i naturalístics de la leishmaniosi.
Lligams:
– Wild rabbits are Leishmania infantum reservoirs in southeastern Spain. Joaquina Martín-Sánchez, Victoriano Díaz-Sáez, Francisco Morillas-Márquez, Victoriano Corpas-López, Patricia Ibáñez-De Haro, Andrés Torres-Llamas, Manuel Morales-Yuste. Zoonoses Public Health (2024).
Des de la Mediterrània 