Cinquanta anys de la tècnica de Bradford

El 7 de maig del 1976, avui just fa mig segle, el bioquímic Marion Mckinley Bradford (1946-2021) publicava a la revista Analytical Biochemistry un article que ha esdevingut un dels més citats en la bibliografia científica: ‘un mètode ràpid i sensible per a la quantificació de micrograms de proteïna utilitzant el principi d’unió proteïna-colorant’. És fàcil d’entendre que hagi estat un article tan citat: la quantificació de proteïna en el rang dels micrograms als mil·ligrams per mil·lilitre és especialment adequada per referir-hi tot un altre ventall de paràmetre bioquímics, de biologia molecular, de química, etc. Si la proteïna, com indica l’etimologia, és el constituent essencial dels organismes vius, expressar tal o tal paràmetre en funció dels micrograms de proteïna present pot resultar més rellevant que fer-ho directament per unitat de volum o de pes general. La pròpia definició de proteïna arrencà amb tècniques de valoració, però aquestes funcionaven òptimament per a suspensions o solucions ben concentrades. La tècnica de Bradford s’adreça especialment a mostres processades en el laboratori de bioquímica o de biologia molecular, i això explica també que en cada recerca que hom l’utilitzi, els autors se sentin obligats a citat l’article del 1976.

Estructura del blau brillant de Coomassie R-250, reactiu emprat en la tècnica de Bradford, per això sovint conegut senzillament com a ‘reactiu de Bradford’

Marion Mckinley Bradford

Marion M. Bradford

Marion Mckinley Bradford va nàixer a Rome, Geòrgia, el 28 d’octubre del 1946. Es graduà al Shorter College d’aquesta localitat el 1967. El 1971 es va casar amb Janet Holliday.

El treball de tesi doctoral de Bradford tractava sobre l’enzimologia de la penetració de l’òvul de mamífer. El seu supervisor era William L. Williams, professor de bioquímica a la University of Georgia. Així doncs, Bradford s’integrà als Reproduction Research Laboratories, que penjaven del Department of Biochemistry d’aquesta universitat, amb seu a Athens. En aquest treball sobre enzims i altres proteïnes resultava vital disposar de tècniques del valoració general de proteïna.

Un mètode de determinació de proteïna amb el colorant Blau Brillant de Kumasi G-250

La tesi doctoral de Bradford, amb el títol ‘Enzymology of penetration of the mammalian ovum’ fou defensada reeixidament el 1975. Podem considerar que el treball sobre la quantificació de proteïnes era un spin off d’aquest treball de tesi. De fet, Bradford & Williams patentaren el mètode.

Val a dir que, abans de presentar la patent, Bradford redactà un article sobre la metodologia.

El punt central fou la selecció d’un colorant amb afinitat específica per a la proteïnes. Bradford seleccionà el Blau Brillant de Coomassie G-250. Aquest colorant fou desenvolupat per Levinstein Ltd., fàbrica de colorants de Blackley, especialitzada en colorants àcids per a la llana. El nom de blau brillant fa referència al resultat que té la seva aplicació sobre la llana, però i el de Coomassie? Aparentment, Levinstein Ltd. seleccionà el nom en homenatge a la conquesta de la vila ashanti homònima per part de les forces angleses en el context de la Quarta Guerra Anglo-Ashanti (1896). És un nom ben imperialista, bo i més si mantenim la grafia anglesa de Coomassie, en contrast amb l’ortografia avui oficial a Ghana: Kumasi. El topònim Kumasi provindria del mot twi ‘Kumase’, derivat de ‘kum’ (arbre) i ‘ase’ (sota). La tradició diu que el tal arbre era un Okum (Prunus) plantat per Okomfo Anokye (1655-1719), és a dir el summe sacerdot ashanti. Sigui com sigui, en el context bioquímic i de biologia molecular, se sol comercialitzar senzillament com a ‘reactiu de Bradford’.

La referència a G-250 no és gratuïta, ja que hi ha més d’una quarantena de colorants que porten el nom de Coomassie. El codi G-250 combina la G referida a colorants verds (i blaus), amb el guarisme 250 en referència a la puresa.

En el seu article Bradford explicava que la unió d’aquest colorant a proteïna provocava un desplaçament en el pic d’absorció del colorant. Si el colorant originari tenia un pic a 465 nm, el colorant unit a proteïna el tenia a 595 nm. D’aquesta manera, Bradford bastia un mètode espectrofomètric de valoració de proteïna assumint que l’augment d’absorció a 595 nm representaria la quantitat de proteïna que interactuava amb el colorant.

Bradford comprovà que l’assaig era molt reproduïble. El procés de tinció esdevenia complet en qüestió de dos minuts, i el color resultant era estable durant l’hora següent.

Bradford també tingué en compte possibles interferències en la unió del Coomassie G-250 amb la proteïna. Mostrà que cations com el sodi o el potassi hi tenien poca o gens interferència. Tampoc no tenien gaire interferència carbohidrats com la sacarosa.

La reacció de coloració, en canvi, sí era molt sensible al pH. En presència d’agents tamponadors fortament alcalins, el color desenvolupat era feble. Així doncs, en el disseny de la tècnica de tinció calia utilitzar un controls de tampons adients que facin de blanc, i que siguin representatius dels tampons presents en les mostres problema.

Un altre factor d’interferència que calia tenir en compte és que en la mostra problema hi hagi una quantitat elevada de detergents habituals en el laboratori de bioquímica com el SDS (sulfat de dodecil sòdic) o Triton X-100, però també de detergents generals utilitzats per netejar material de vidre. Per fer front a aquestes interferències resultava cabdal utilitzar controls adients, és a dir tant mostres blanques com patrons de proteïna coneguda tractats de manera anàloga a les mostres problema.

L’ús d’una recta patró de proteïna coneguda pot posar de manifest en quin rang de concentracions hi ha una relació lineal entre l’absorbància a 595 nm i la concentració de proteïna en mg/L. Si pensem en els protocols habituals d’extracció del laboratori bioquímic o biològic, detergents i pH poden fer fracassar més d’una recta patró, i el nom de Bradford és blasmat llavors com a culpable.

Bradford trameté el seu article a la revista Analytical Biochemistry l’11 de setembre del 1975. La revista l’acceptà després d’un procés de revisió el 29 de gener del 1976, i el publicà el 7 de maig.

El 1977 Bradford aconseguí una posició de recerca en bioquímica a la University of Georgia. En aquells anys, la tècnica de Bradford esdevingué un element quotidià en laboratoris de tot el món, i l’article metodològic del 1976 apareixia de forma habitual en els més diversos articles. El 1983, Bradford deixava la universitat per incorporar-se a A. E. Staley, per treballar-hi en el departament de recerca bioquímica d’aquesta companyia alimentària especialitzada en l’elaboració de midons i edulcorants amb seu a Decatur, Illinois. El 1988 la companyia fou adquirida per Tate & Lyle, i Bradford continuà fent recerca aplicada fins a jubilar-s’hi. Com a investigador emèrit fou consultor de la Iowa Corn Growers Association. Es va morir a Hendersonville, North Carolina, el 3 de maig del 2021.

Lligams:

– A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Marion M. Bradford. Analytical Biochemistry 72: 248-254 (1976).

– Protein-assay reagent and method. US4023933A Patent 1976