Quan pensem en dinoflagel·lats potencialment perilloses pensem en espècies d’algues unicel·lulars planctòniques. Però també hi ha dinoflagel·lats tòxics que no són planctònics, és a dir que no suren en la mar, sinó que viuen associats al fons marí (és a dir, que són bentònics) i, molt especialment, epífits (és a dir, que viuen damunt d’altres espècies animals o vegetals del fons marí). Els dinoflagel·lats bentònics no són rars en ecosistemes tropicals, però sí ho són a la Mediterrània. O ho eren, ja que l’escalfament de les aigües mediterrànies facilita l’establiment d’aquestes espècies termofíliques en les nostres aigües. Un grup d’investigadors, encapçalat per Hela Ben-Gharbia, del Grup de Recerca en Oceanografia i Ecologia Planctònica de l’Institut Nacional d’Agronomia de Tunísia (INAT), reporta en les planes de la revista Toxin, de Basilea, l’isolament de tres espècies de dinoflagel·lats bentònics termofílics en la badia de Bizerta. N’han estudiat els ritmes de creixement i les toxines que produeixen.
Panoràmica de la ciutat de Bizerta, que mostra les instal·lacions portuàries i el canal que comunica el llac amb la badia
Una recerca a la badia de Bizerta
El Grup de Recerca en Oceanografia i Ecologia Planctònica és adscrit a l’Institut Nacional d’Agronomia i a la Universitat de Cartago, a Tunis. En aquesta investigació han participat tres membres del grup, Hela Ben-Gharbia, Ons Kéfy-Daly Yahia i Habiba Zmerli Triki. També ha participat Habiba Nouri, de la seu de Tunis de l’Institut de Recerca pel Desenvolupament (IRD). Del Laboratori de Ficotoxines de l’Institut Francès de Recerca per l’Explotació de la Mar (IFREMER), amb seu a Nantes, han participat Zouher Amzil i Manoella Sibat. Del Laboratori de Recursos Ambientals de la Bretanya Occidental (LER/BO), a Concarneau, ha participat Nicolas Chomérat. Del Centre per la Biodiversitat, Explotació i Conservació Marines (MARBEC), de Montpelhièr, han participat Eric Abadie, Estelle Masseret i Mohamed Laabir. Laabir va poder fer l’estada a Tunísia gràcies al finançament de l’IRD. Part de la recerca serví per al treball de tesi doctoral de Ben Gharbia, recolzada en el finançament del Laboratori Mixt Internacional de Contaminants i Ecosistemes Marins Sud-Mediterranis (LMI COSYS-Med). L’anàlisi de les toxines fou finançat en el marc dels projectes OCEAN-15 i ANR-15-CE35-0003 de l’Agència Nacional Francesa de Recerca.
Després d’assessorar-se amb Mohamed Néjib Daly Yahia i Bilel Loussaieft, se seleccionà com a localitat de mostreig la Badia de Bizerta. Es tracta d’una zona portuària connectada amb una llacuna semi-tancada. La llacuna és una de les zones de major aqüicultura a Bizerta, com ara muscleres i ostreres. L’àrea ha patit esporàdics creixements d’algues tòxiques (Alexandrium, Dinophysis, Prorocentrum, Pseudo-nitzschia). Normalment, però, els nivells d’aquestes algues són moderats, i la més freqüent, Prorocentrum lima, pot arribar a concentracions de 104 cèl·lules/litre en la llacuna.
Cymodocea nodosa, en el litoral alacantí. Pròpiament parlant, no es tracta d’una alga, sinó d’una planta marina. Creix en litorals sorrencs, arribat fins a 30 metres de profunditat. Damunt les seves fulles viu una variada comunitat epifítica, d’algues, invertebrats, peixos (magre,sarg, moll), especialment quan arribar a forma gespes prou denses. Té una distribució atlanto-mediterrània
Per a la recol·lecció d’epifits, Ben-Gharbia et al. colliren fulles de la planta marina Cymodocea nodosa, a fondàries entre 50 i 100 cm. Les fulles eren col·locades en recipients de plàstics plens d’aigua de mar. En el laboratori, per cada 20 grams de fulles se les traslladava a un altre recipient de 250 mL d’aigua marina filtrada (per porus de 0,18 mm), i se les sacsava per desprendre les microalgues. La part líquida era filtrada en una malla de 0,02 mm, i el resultat era observat amb un microscopi òptic invertit.
Cèl·lula d’Ostreopsis ovata. Els dinoflagel·lats són algues unicel·lulars dotades de mobilitat gràcies a un parell de flagels. No totes les espècies, però, són planctòniques, i algunes tendeixen a viure associades al fons marí, freqüentment com a epífits
L’abril del 2014, d’aquesta manera, isolaren cèl·lules de Prorocentrum lima, d’una banda, i de Coolia monotis, de l’altra. El mes de juliol del 2014, isolaren en un segon mostreig cèl·lules del gènere Ostreopsis.
Després de diversos passos, Ben-Gharbia establí tres soques algals: OOBZT14 (O. cf. ovata), PLBZT14 (P. lima) i CMBZT14 (C. monotis). Les sigles BZT14 fan referència a la localitat (Bizerta) i a l’any de recol·lecció.
La feina al laboratori
Mohamed Laabir i Ons Kéfy-Daly Yahia dissenyaren tan el mostreig com els experiments que s’hi farien al laboratori.
De les tres soques isolades de la Badia de Bizerta, Ben-Gharbia va fer un estudi morfològic (microscopi òptic, microscopi d’epifluorescència). A través de l’extracció d’ADN, Nicolas Chomérat va poder fer un estudi filogenètic comparant seqüències de gens ribosòmics del GenBank.
Pel que fa a les característiques de creixement, Ben-Gharbia féu seguiment de cultius tancats de 250 mL durant 1-2 mesos, mesurant-hi la concentració cel·lular. D’aquestes dades se’n deduïda la taxa màxima de creixement, és a dir la corresponent a la fase exponencial d’amplificació del cultiu.
Fou d’aquests cultius que, tant en la fase de creixement exponencial com en la fase d’estabilització, se’n prengueren 28 μL del medi per valorar la generació de toxines. Amb una centrifugació es recuperaren les cèl·lules d’aquesta alíquota. Les mostres de cèl·lules foren dissoltes després en metanol i s’hi va fer una extracció per poder analitzar-les per cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS). L’anàlisi de toxines fou realitzat per Zouher Amzil i Manoella Sibat.
Ostreopsis ovata
Ostreopsis ovata fou descrita originàriament per Fukuyo en el 1981 en esculls coral·lins de la Polinèsia. En la passada dècada aquesta espècie assolí proliferacions tòxiques amb impacte sanitari en diversos punts de la Mediterrània Occidental. En aquelles ocasions, la microalga formava agregats flotants en la superfície, i una part de les afectacions es degué a la formació d’aerosols i els consegüents efectes irritants. Entre les toxines que produeix aquesta espècie hi ha la palitoxina, les ovatoxines i les mascarenotoxines.
La soca OOBZT14 ha estat temptativament identificada amb l’espècie O. ovata. En el laboratori s’adhereix a les parets del recipient una forma una mena de teranyina mucosa de color bru. En la fase exponencial, les cèl·lules tenen unes dimensions mitjanes de 50 micres de llarg i 37 d’ample; en la fase de creixement estacionari, són una mica més grans i arrodonides.
La comparació filogenètica mostra que OOBZT14 és similar a soques de O. cf. ovata isolades a França, Itàlia i Grècia.
En el cultiu del laboratori OOBZT14 assoleix la densitat màxima (13 cèl·lules/mL) després de 24 dies de creixement, amb una taxa màxima de 0,59 cicles/dia (en els dies 2-8 de cultiu).
Pel que fa a les toxines, de OOBZT14 tan sols s’ha detectat l’ovatoxina-a i l’ovatoxina-b.
Prorocentrum lima
Prorocentrum lima fou descrita originàriament en el Golf de Sorrento, però es tracta d’una espècie de distribució cosmopolita i relativament abundant. Se l’ha implicat en intoxicacions alimentàries per consum de mol·lusc i de peixos. Entre les toxines que produeix hi ha l’àcid okadaic, les dinofisistoxines, el prorocentròlid i la prorocentrina.
La soca PLBZT14 és assignada a aquesta espècie. En els recipients de laboratori apareix adherida al fons, formant un tapís dens. Les cèl·lules són ovalades (amb llargades de 43-49 micres, i amplades de 35-38 micres).
Filogenèticament, PLBZT14 és molt similar a altres soques de P. lima isolades a Itàlia o al litoral atlàntic d’Espanya.
En el cultiu del laboratori, PLBZT14 assolí la densitat màxima (32 cèl·lules/mL) després de 60 dies, amb una taxa de creixement màxima de 0,33 cicles/dia.
En les cèl·lules de PLBZT14 s’hi detectaren àcid okadaic i dinofisistoxina-1. Es tracta d’una soca altament toxigènica, amb nivells que arriben a 28,33 pg d’àcid okadaic per cèl·lula en el dia 12 de cultiu.
Estructura química de l’àcid okadaic. Aquesta substàncies és un potent inhibidor de protein-fosfatases i per tant el seu mecanisme d’acció s’explica pel foment de la hiperfosforilació intracel·lular. Val a dir, que aquesta acció inhibidora l’ha fet una substàncies d’interès en els laboratoris de biologia molecular. Hom ha estudiat l’aplicació d’aquesta substància per a diferents usos mèdics. En intoxicacions alimentàries per peix o marisc contaminat amb dinoflagel·lats que en produeixen, es calcula que una dosi de 40 μg ja és prou elevada com per produir diarrea. És a dir, que n’hi hauria prou amb ingerir 2000 cèl·lules de la soca PLBZT14
Coolia monotis
Coolia monotis fou descrita per primera vegada per Meunier en el 1919 en ostreres de Deswartes, a la Mar del Nord. En principi se la considera una espècie no-tòxica, per bé que no es descarta que puguin haver-hi soques que sí ho siguin.
La soca CMBZT14 fou adscrita a aquesta espècie. A diferència de les altres dues espècie, les cèl·lules CMBZT14 són més actives i segueixen en el laboratori un moviment rotacional en sentit contrari a les busques del rellotge. Són cèl·lules de morfologia lenticular, comprimides anterior-posteriorment, amb uns diàmetre de 28 a 33 micres.
Filogenèticament, CMBZT14 és similar a algunes soques de C. monotis isolades a Grècia i Països Baixos.
En el cultiu de laboratori, CMBZT14 assoleix la densitat màxima (27 cèl·lules/mL) després de 24 dies, amb una taxa màxima de 0,35 cicles/dia.
Pel que fa a la producció de toxines de CMBZT14 no han trobat gaire cosa, a banda d’un component sospitós que serà matèria d’investigacions addicionals.
Una amenaça potencial?
De les tres soques isolades a la badia de Bizerta, dues (OOBZT14 i PLBZT14) són tòxiques. Les dades de creixement indiquen que l’escalfament de les aigües degut al canvi climàtic podrien promoure totes dues espècies a les aigües tunisines. OOBZT14 presenta una taxa de creixement màxima que la podria fer predominant per damunt de les altres microalgues. PLBZT14 té una taxa de creixement inferior, i té menys capacitat dispersiva que OOBZT14, però genera una quantitat major de toxines. Si OOBZT14 podria generar potencialment aerosols tòxics, una concentració localitzada de PLBZT14 podria afectar si arribés a entrar en la xarxa alimentària a través de muscleres i ostreres.
Ben-Gharba et al. posen de manifest la complexitat de factors ambientals (temperatura, salinitat, insolació, composició en oligoelements) en les dinàmiques de creixement dels dinoflagel·lats. En el repàs bibliogràfic que fan remarquen la variabilitat inter- intraspecífica pel que fa a la producció de toxines.
Els programes de monitorització a la Mediterrània tenen en compte sobretot les espècies planctòniques, però Ben-Gharba et al. recomanen també tindre present el possible impacte dels dinoflagel·lats epifítics i bentònics.
La publicació
Ben-Gharbia i Laabir redactaren l’article, que fou després corregit i millorat per Eric Abadie i Estelle Masseret. Habiba Nouri hi adjuntà el material cartogràfic. Dorra Ben-Gharbia en va fer un repàs lingüístic, abans de sotmetre’l a la revista Toxins el 16 d’agost del 2016. El procés de revisió fou dirigit per John P. Berry i l’article fou acceptat el 30 de setembre del 2016.
Lligams:
– Toxicity and Growth Assessments of Three Thermophilic Benthic Dinoflagellates (Ostreopsis cf. ovata, Prorocentrum lima and Coolia monotis) Developing in the Southern Mediterranean Basin. Hela Ben-Gharbia, Ons Kéfi-Daly Yahia, Zouher Amzil, Nicolas Chomérat, Eric Abadie, Estelle Masseret, Manoella Sibat, Habiba Zmerli Triki, Habiba Nouri, Mohamed Laabir. Toxins 8, 297; doi:10.3390/toxins8100297.
Des de la Mediterrània 