La llebre del Cap (Lepus capensis L., 1758), també coneguda com a llebre bruna o llebre del desert, viu en un ampli rang d’hàbitats a Àfrica i al sud-oest asiàtic. Potser això explica la considerable diversitat fenotípica d’aquesta espècie, de la qual s’han reconegut dotze subespècies. A Tunísia, per exemple, contrasta la morfologia de les poblacions segons si viuen en àrees mediterrànies sub-humides, en àrees semi-àrides o en l’àrid clima saharià. Subjacent a aquesta diversitat fenotípica hi ha una notable homogeneïtat genètica. Això fa aquesta espècie interessant per estudiar els mecanismes d’adaptació de gens del metabolisme central, com ara els implicats en el sistema mitocondrial de la fosforilació oxidativa, base de la respiració cel·lular. Hichem Ben Slimen, en col·laboració amb Helmut Schaschl, Felix Knauer i Franz Suchentrunk, publiquen a BMC Evolutionary Biology un article on mostren la selecció dels gens mitocondrials ATP sintasa 6 i NADH deshidrogenasa 2, associada al gradient de temperatura i precipitacions.
Una llebre del Cap, al nord de Tanzània
Un estudi de biologia molecular en fauna salvatge
Aquesta recerca fou dissenyada per Hichem Ben Slimen, Helmut Schaschl i Franz Suchentrunk. Ben Slimen és membre de la Unitat de Genòmica d’Insectes d’Interès Agronòmic de la Universitat de Tunis El-Manar i de l’Institut Superior de Biotecnologia de Beja. Schaschl és professor de genètica humana en el Departament d’Antropologia de la Universitat de Viena. Suchentrunk és membre de l’Institut de Recerca d’Ecologia de Vida Salvatge de la Universitat de Medicina Veterinària de Viena.
Tataouine (a la imatge), al sud de Tunísia, fou una de les regions meridionals, més desèrtiques, incloses en el mostreig, realitzat entre el 2003 i el 2006
En virtut d’un permís sol·licitat al Ministeri d’Agricultura, Recursos Hídrics i Pesca, entre el 2003 i el 2006, durant les temporades de cacera, recolliren un total de 133 llebres procedents d’onze localitats diferents, dues al nord (Béja i SidiThabet), sis al centre (Nadhour, Weslatia, Kalâa, Bekalta, Cherarda i Sned) i tres al sud (Douz, Tataouine i Ben Guerdène).
Com a grup extern, s’afegiren tres mostres de llebre del Cap de fora de Tunísia, procedents de la regió d’Overberg (El Cap), de Matruh (Desert Occidental d’Egipte) i del Sinaí, a banda de dos espècimens de L. saxatilis (de El Cap) i de L. europaeus (de Zwerndorf, Àustria).
Les mostres foren dutes al Laboratori de Genètica de l’Institut de Suchentrunk, i bona part de la feina experimental la realitzà Anita Haiden, comptant amb els recursos del projecte de recerca de Suchentrunk. S’extragué l’ADN genòmic total de diferents teixits (fetge, múscul esquelètic, cartílag de l’orella, llengua, etc.). L’amplificació del gen ATP6 cobria un segment de 453 pb (corresponent posicions 8142-8594 del genoma mitocondrial de Lepus europaeus). L’amplificació del gen ND2 cobria un segment de 409 pb (corresponent a les posicions 4066-4474 del genoma mitocondrial). Els amplicons foren seqüenciats. També s’amplificà, com a regió control, el domini hipervariable 1 (HV1) del genoma mitocondrial (461 pb). A banda d’això, cada espècimen fou genotipat per a 14 loci de microsatèl·lits.
Esquema de la fosforilació oxidativa en l’interior dels mitocondris. El cicle de l’àcid cítric (cicle de Krebs) forneix el poder reductor que alimenta la cadena de transport electrònic (on trobem la NADH deshidrogenasa, entre d’altres), que s’associa a una extrusió de protons a l’espai intermembrana. El gradient de protons permet a l’ATP sintasa la fosforilació d’ADP a ATP.
Ben Slimen s’encarregà de la majoria de la feina d’estatística molecular. Felix Knauer, col·lega de Suchentrunk, col·laborà amb ell en el desenvolupament dels models lineals. Els quatre autors, en general, participaren en l’anàlisi de les dades, per bé que foren Ben Slimen i Schaschl els qui redactaren l’article. El manuscrit arribà a BMC Evolutionary Biology l’11 d’agost del 2016. Ben Slimen i Schaschl revisaren el text, que rebé el vist-i-plau de Knauer i Suchentrunk, i fou acceptat per la revista el 26 de gener. El 7 de febrer era publicat.
La modelització
Mapa de Tunísia amb els gradients de precipitació, les localitats estudiades i les freqüències al·lèliques per a les proteïnes ATP6 i NADHDH2 de les regions sub-humida, semi-àrida i àrida. Per a cada proteïna es distingeix un al·lel ancestral (A), de diversos al·lels derivats (B, C, D).
A partir de l’anàlisi i arrenglerament de seqüències, Ben Slimen et al. determinaren la diversitat d’haplotips, la diversitat nucleotídica, el nombre mitjà de diferències i el nombre de posicions polimòrfiques per a cadascuna de les regions, nord, central i sud. De les seqüències gèniques deduïren les seqüències aminoacídiques, i amb elles reconstruïren les relacions filogenètiques dels diferents haplotips.
Amb el mètode de màxima probabilitat, per a cada posició aminoacídica, s’analitzaven les taxes de substitució nucleotídica. La substitucions nucleotídiques poden comportar o no una substitució aminoacídica, i així hom parla, respectivament, de substitucions no-sinònimes i de substitucions sinònimes. El valor ω serà igual a 1 en cas d’una evolució neutra, major a 1 en cas d’una evolució sota selecció positiva i menor a 1 en cas d’una selecció negativa. A més d’aquest mètode, Ben Slimen et al. aplicaren d’altres (SLAC, FEL, REL, MEME).
La diferenciació genètica per ATP6 i ND2 fou comparada amb la diferenciació obtinguda en HV-1 i en els 14 microsatèl·lits del genoma nuclear analitzats.
De les seqüències gèniques pogueren deduir doncs variants proteiques i assignar-les un caràcter ancestral (A) o derivat (B, C, etc.). Creuaren aquestes dades amb les dades climatològiques de cada localitat, emprant els registres de les estacions meteorològiques més properes. Les dades climatològiques que empraren foren: la temperatura mitjana anual, la temperatura mínima mitjana del mes més fred de l’any i la precipitació mitjana anual.
Els resultats
Dels 133 espècimens analitzats, Ben Slimen et al. detecten 34 haplotips per al gen ATP6 i 41 haplotips per al gen ND2. El gen ATP6 (399 pb) presenta 40 posicions variables, mentre que el gen ND2 (348 pb) en presenta 47. Aquesta diversitat nucleotídica es redueix a nivell proteic: la proteïna ATP6 mostra 4 al·lels (diferenciats en 2 posicions) i la proteïna ND2 presenta uns altres 4 al·lels (diferenciats en 4 posicions).
En el cas de l’ATP6, la proteïna ancestral presentava una freqüència del 53,38%. L’al·lel derivat B, amb una freqüència de 44,3%, era present en 6 haplotips diferent. L’al·lel D (1 sol haplotip; 0,8%) hauria derivat de l’al·lel B, mentre que l’al·lel C (2 haplotips; 1,5%) ho hauria fet directament de l’al·lel A.
En el cas de l’ND2, la proteïna ancestral presentava una freqüència del 89,47%. De l’al·lel A haurien derivat els al·lels B (8 haplotips; 8,3%) i C (1 haplotip; 0,8%). L’al·lel D (1,5%) hauria derivat en dues ocasions independents.
Els models utilitzats mostren que en els gens ATP6 i ND2 domina una selecció purificadora o conservadora. Hi podria haver, però, selecció positiva per a ATP6 en la mutació A8408G (posició 72), és a dir que la que condueix de l’al·lel A a l’al·lel B. Pel que fa al gen ND2, podria haver selecció positiva en les mutacions M4171L (posició 16), H4189Y (posició 22) i L4199P (posició 25).
La variació genètica d’ATP6 i ND2 s’associa a la partició en les tres regions en un 19%, mentre que la variació d’HV-1 i dels microsatèl·lit ho fa en menor mesura (5% i 2% respectivament). La proteïna A d’ATP6 i la proteïna B de ND2 mostren una associació petita amb la regió central de Tunísia.
L’homogeneïtat genètica de les llebres del Cap de Tunísia
Les diferents poblacions mostren una gran disparitat pel que fa a la mida corporal o al color, associades a l’adaptació a la vida desèrtica. Genèticament, però, com mostres les dades de mtHV-1 i de microsatèl·lits, hi ha una notable homogeneïtat i continuïtat.
L’estudi mostra una selecció positiva per al gen ATP6, que explicaria per quina raó la variant proteica ancestral té una freqüència gènica més elevada en el sud desèrtic que no pas en el nord mediterrani. Així, la variant ancestral presenta una correlació amb la temperatura mitjana anual.
En el cas del gen ND2, les variants A i B s’associen especialment amb la temperatura mínima mitjana del mes de febrer.
Ben Slimen et al. són conscients que el seu estudi no inclou dades funcionals. Per obtindre-les caldria fer experiments bioquímics sobre les diferents variants, alhora que analitzar en treballs de camp les taxes metabòliques de llebres vives genotipades. La pressió selectiva associada a diferències tèrmiques podria concentrar-se especialment en els primers moments de la vida post-natal, particularment en l’època més freda, plujosa i ventosa, quan una bona part del metabolisme oxidatiu s’encamina a la termoregulació. Però també podria estendre’s durant tota la vida per afavorir una taxa metabòlica basal el més moderada possible en climes àrids.
Lligams:
– Selection on the mitochondrial ATP synthase 6 and the NADH dehydrogenase 2 genes in hares (Lepus capensis L., 1758) from a steep ecological gradient in North Africa. Hichem Ben Slimen, Helmut Schaschl, Felix Knauer, Franz Suchentrunk. BMC Evolutionary Biology 17: 46 doi:10.1186/s12862-017-0896-0 (2017).
Des de la Mediterrània 