Com discriminar entre dues espècies invasives de copèpodes paràsits de musclos i ostres: ‘Mytilicola intestinalis’ i ‘Myticola orientalis’ (Zoologia mediterrània, 11/2018)

Quan parlem d’espècies invasores en aquesta sèrie fem referència normalment a aquelles que s’han establert en ecosistemes mediterranis. Però avui canviarem de terç, i parlarem d’una espècie mediterrània invasora, és a dir una espècie originària de la nostra regió i que s’ha establert en altres contrades. A final dels anys 1930, Mytilicola intestinalis, un copèpode paràsit originàriament descrit en poblacions mediterrànies del musclo Mytilus galloprovincialis, fou trobat en bivalves nadius dels Països Baixos. Per al naixent negoci de la conquilicultura esdevingué un problema típic d’espècie invasora procedent de la Mediterrània. En els anys 1970, arribà al litoral neerlandès un altre copèpode paràsit del mateix gènere, però d’una espècie en aquest cas japonesa, Mytilicola orientalis. La semblança entre les dues espècies va fer que sovint M. orientalis passés a ulls de professionals i tècnics de les muscleres neerlandeses com a M. intestinalis, amb la qual cosa esdevenia un “invasor críptic”. Per fer el seguiment d’aquestes espècies, però, és important diferenciar-les. En el marc del seu treball de tesi, defensada reeixidament el passat 3 de novembre a la Universitat Lliure d’Amsterdam, M. Anouk Goedknegt treballà, entre d’altres aspectes, en la discriminació de les dues espècies citades. Aquesta setmana apareix a PLoS One un article encapçalat per Goedknegt on es recomana l’ús de tècniques moleculars per diferenciar M. orientalis de M. intestinalis.

Aquests dibuixos de Felipe Ribas posen de manifest la diferència morfològica de Mytilicola intestinalis i Myticola orientalis. Les dues espècies de copèpodes es diferencien també des d’un punt de mira ecològic. A la pràctica, però, hi ha hagut reports de M. intestinalis que realment feien referència a M. orientalis.

Mytilicola orientalis com a espècie invasora críptica en el Delta Holandès i en la Mar de Wadden

Anouk Goedknegt és doctora en ecologia marina. La tesi, com hem dit, la defensà el passat mes de novembre. El treball, realitzat a l’Institut Reial de Recerca Marina (NIOZ), tractava sobre els efectes d’espècies invasives en les interaccions hoste-paràsit, amb especial èmfasi en l’ostra invasiva del Pacífic Magallana gygas i en els copèpodes que la parasiten, també invasius, Mytilicola orientalis i Mytilicola intestinalis, en el marc del Delta Holandès i de la Mar de Wadden. La tesi implicà treball de camp, disseny experimental i anàlisi estatística avançada.

Goedknegt i K. Mathias Wegner, de l’Alfred-Wegener-Institut d’Alemanya, conceberen un estudi focalitzat en M. orientalis com a espècie críptica en el sentit de reportada de vegades incorrectament com a M. intestinalis. David W. Thieltges i Pieternella C. Luttikhuizen, del Departament de Sistemes Litorals del NIOZ, juntament amb Wegner, forniren dades. En l’anàlisi formal participaren Goedknegt i Jaap van der Meer, del mateix Departament. Goedknegt i Thieltges redactaren una proposta d’article, que fou revisada per Van der Meer, Wegner i Luttikhuizen. El 20 de desembre del 2016 el trameteren a la revista PLoS, que n’encarregà l’edició a Elena Gorokhova, de la Universitat d’Estocolm. Després d’un procés de revisió, l’article fou acceptat el 9 de febrer d’enguany i publicat el 14 de març.

El mostreig de camp i les anàlisis moleculars es finançaren a través de l’Organització Neerlandesa de Recerca Científica (NWO) i del Ministeri Federal alemany d’Educació i Ciència, en el marc del projecte conjunt NWO-ZKO 839.11.002, liderat per Thieltges.

Fou en el 1939, quan H. Caspers descrigué la presència del copèpode paràsit Mytilicola intestinalis en el tracte intestinal de bivalves autòctons de la Mar del Nord. Aquesta espècie i aquest gènere havien estat descrits per Aldolf Steuer en 1902, com a paràsit intestinal del musclo Mytilus galloprovincialis en la Mar Adriàtica. El Mytilus galloprovincialis és anomenat de vegades com a “musclo del Mediterrani”, i la seva distintivitat com a espècie havia estat propugnada inicialment el 1819 per Lamarck. Calia pensar que M. intestinalis havia arribat a la Mar del Nord transportat en musclos incrustats en els cascs de vaixells.

L’any anterior, en el 1938, hom havia reportat un fenomen semblant a la Colúmbia Britànica, amb l’arribada de Mytilicola orientalis. Aquesta espècie de copèpode paràsit havia estat descrita el 1935 per T. Mori en budells de l’ostra Magallana gigas. Precisament, M. orientalis arribà a la Colúmbia Britànic a través de partides d’aquesta ostra. M. gigas és en ella mateixa una espècie invasora, i a través seu, en els anys 1970, M. orientalis fou registrat en el litoral francès en els anys 1970. Des de França, aquest copèpode arribà al Delta d’Holanda i a la Mar de Wadden.

Quan M. orientalis arribà a aigües neerlandeses era confosa, si més no en alguna ocasió, amb M. intestinalis, i d’ací que Goedknegt la citi com un exemple d’“invasor críptic”. Genèticament són properes, com mostra la seqüència del gen mitocondrial de la citocrom c-oxidasa I (COI), amb una diferència interespecífica del 16,08% i unes diferències intraspecífiques negligibles. Aquesta diferència es correspondria a una separació de llinatges de 7-11 milions d’any.

Mori havia descrit M. orientalis prenent M. intestinalis com a espècie tipus del gènere. Les característiques diagnòstiques eren:
– unes protuberàncies toràciques dorsolaterals més prominents en M. orientalis.
– l’absència de protuberàncies dorsolaterals en el primer segment toràcic dels mascles de M. orientalis.
– un llavi superior triangular en M. orientalis i arrodonit en M. intestinalis.

En les femelles de M. orientalis els ovisacs són més llargs. Els rams caudals d’aquestes espècie són paral·lels o gairebé, mentre que en M. intestinalis són divergents.

En termes generals, els mascles de les dues espècies, que són més petits en tots dos casos, són més semblants.

Diferències morfològiques a banda, hi ha diferències ecològiques entre les dues espècies. M. intestinalis parasita principalment musclos i M. orientalis parasita sobretot ostres. Ara bé, Goedknegt et al. sospiten que en la bibliografia hi ha estudis que confonen totes dues espècies. Això té conseqüències en la valoració de l’impacte econòmic i ecològic de cada espècie. Per exemple, posen en dubte que M. intestinalis parasiti l’ostra del Pacífic M. gigas. En qualsevol cas, les dues espècies sí semblen poden infectar el musclo blau (M. edulis) i l’escopinya comuna (Cerastoderma edule).

Mesures morfològiques quantitatives

Goedknegt et al. utilitzaren col·leccions de copèpodes recollits en mostres de musclo blau i d’ostra del Pacífic del Delta Holandès (recollides el maig del 2012) i de la Mar de Wadden (entre el 2010 i el 2012).

Les àrees estudiades es corresponen a tres zones del litoral dels Països Baixos Germànics: el Delta de Zelanda i Holanda, l’illa de Texel (Holanda del Nord) i l’illa de Söl (Frísia del Nord)

Aquestes col·leccions s’elaboraren a partir d’un total de 109 ostres del Pacífic i de 198 musclos blaus. Hom mesurava la longitud màxima de cada closca amb calibres de Vernier (120 mm de mitjana per a l’ostres i 47 mm per als musclos) abans d’obrir-los i cercar el teixit a la recerca d’individus de Myticola sota una lupa de 3-8x. Els copèpodes individuals eren retirats i guardats en etanol 96%.

Se seleccionà un total de 20 individus de Myticola del Delta Holandès i 25 individus de la Mar de Wadden. Goedknegt procedí a la identificació específica, basant-se en la direcció de les protuberàncies toràciques dorsoventrals, segons si eren plegades cap endins (M. intestinalis) o esteses cap enfora (M. orientalis), i en la forma dels rams caudals (grossos i divergents en M. intestinalis i estrets i paral·lels en M. orientalis). Les femelles eren identificades per la presència d’ovisacs o, en el seu defecte, per la forma trapezoïdal del cefalosoma i la manca de maxil·lípede. D’aquesta manera cada mitícola era assignat a una de les dues espècies i a un dels dos sexes.

Distribuïts els individus, Goedknegt els microfotografiava (a 10x en el cas de les femelles i a 30x en el cas dels mascles). Aquestes imatges permetien posteriorment mesurar la longitud del cefalosoma, l’amplada corporal i la longitud corporal. També es mesurava l’angle entre els rams caudals i l’eix anteroposterior; el nombre de segments corporals amb protuberància toràctiques dorsolaterals i la seva direcció; i la longitud de la doble somita genital en el cas de les femelles.

En el cas de M. orientalis, Goedknegt estudiaren la relació entre la mida corporal i si eren originaris d’un musclo o d’una ostra, tenint també present la intensitat de parasitació de l’hoste (és a dir el nombre de mitícoles per cada bivalve).

Goedknegt et al. estudiaren addicionalment els efectes de la preservació i del mètode de conservació en la morfologia. Ho feren a partir de mostres de musclos blaus procedents de dues localitats de Texel, Vlakte van Kerken i Mokbaai. S’extreien els mitícoles que hi pogués haver i se’ls repartia en dos grups:
a) els mitícoles eren mesurats i després guardats en etanol a 96%, per fer després una nova mesura dues setmanes després.
b) els mitícoles eren mesurats i després guardats congelats a -20ºC durant sis setmanes, per ésser després descongelats, mesurats, guardats en etanol 96% i mesurats de nou dues setmanes més tard.

La identificació genètica per RFLP

El gen mitocondrial COI, en realitzar una funció metabòlica bàsica en la respiració cel·lular, es troba força conservat i la seva seqüència constitueix un rellotge molecular en estudis evolutius. Goedknegt et al. han desenvolupat primers específics de taxon a partir de les seqüències publicades d’aquest gen per a les dues espècies. Aquests primers són:
-MOICOIf 5′-CTTAATTACAGGGGTMTGATCGG-3′
-MOICOIr 5′-TCGATCTGTTAAAAGCATAGTAATYG-3′

L’ús d’aquests primers genera un producte de PCR de 583 parells de bases, que cobreix un fragment de 534 parells de bases del gen COI. Goedknegt et al. han desenvolupat un assaig diagnòstic per poliformisme de fragment de restricció, aprofitant la diana CC/SGG (S = C o G) de l’enzim de restricció Ncil. Mentre que en el fragment de M. intestinalis hi ha una sola diana, en el fragment de M. orientalis n’hi ha dos. Així, en el primer cas, en resulten dos fragments de restricció de 366 i 217 parells de bases, mentre que en el segon cas apareixen tres fragments (286, 222 i 75 parells de bases). Els fragments resultants es poden separar en una electroforesi en gel d’agarosa 2% durant 2 hores a 60 V.

L’assaig COI fou aplicat als 307 individus identificats morfològicament

Una altra seqüència conservada és l’ITS1. Per a aquesta seqüència Goedknegt han desenvolupat un assaig TaqMan. Amb aquesta tècnica s’amplifica una regió i hom distingeix el polimorfisme nucleotídic únic que diferencia les dues espècies, a través de l’ús de dues sondes diferents:
– Myt_ITS_intP 5’FAM-ACATATGAGCATCGACAATTTGAACGC-3’BHQ1
– Myt_ITS_oriP 5’HEX-AGCATCGACACTTTGAACGCATATTGC-3’BHQ1.

L’assaig ITS1 fou aplicat als 75 individus procedents de Texel.

L’anàlisi morfomètrica multivariada

Foren set els paràmetres morfomètrics considerats:
– longitud corporal.
– longitud del cefalosoma.
– amplada corporal.
– angle entre el ram caudal i l’eix anteroposterior.
– el nombre de segments corporals.
– la direcció de les protuberàncies toràciques dorsolaterals.
– la doble-somita genital (sols femelles).

Hom tenia present únicament els mitícoles derivats de musclo blau. En feien l’anàlisi de components principals i l’anàlisi de funció discriminant.

Els resultats genètics

Dels 307 mitícoles identificats morfològicament, van ser assignats genèticament per RFLP-COI a una de les dues espècies uns 292. N’hi hagué, doncs, 15 casos amb patrons de banda inesperats (1 sense tall; 8 amb un patró de bandes de les dues espècies; 6 amb un patró de digestió incompleta). Aquests 15 individus foren retirats de les anàlisis ulteriors.

Dels altres 292 individus, n’hi havia 40 femelles i 47 mascles de M. intestinalis i 109 femelles i 96 mascles de M. orientalis.

Dels 75 individus de Texel analitzats per TaqMan-ITS, tots pogueren ser assignats a una de les dues espècies. Del 68 individus, n’hi havia dades utilitzables tant de RFLP-COI com de TaqMan-ITS: en tots aquests les assignacions específiques foren idèntiques. No se’n detectà, doncs, cap híbrid genètic.

Diferències morfomètriques segons l’hoste i la intensitat de parasitació

El dimorfisme sexual dels mitícoles és confirmats en termes de mida, amb les femelles més grans que els mascles.

En el cas de M. orientalis, els individus procedents d’ostres són més grans que els procedents de musclos. En musclos hi ha una correlació positiva en la mida de l’hoste i la mida del paràsit, però aquesta correlació no s’observa en ostres.

En “M. orientalis” és clara la diferència de mida corporal entre mascles (2-3 mm) i femelles (5-8 mm). En termes generals, són més grans els mitícoles procedents d’ostres que els de musclos

La càrrega parasitària no sembla afectar la mida M. orientalis ni en musclos ni en ostres. En M. intestinalis, en canvi, hi ha una correlació positiva, de manera que un nombre més elevat de mitícoles s’associa a mitícoles més llargs.

Goedknegt et al. no han trobat diferències regionals, entre el Delta de Zelanda-Holanda i la Mar de Wadden pel que fa a la mida dels mitícoles procedents de musclos. En els M. orientalis procedents d’ostres tendeixen a ser més llargs els del Mar de Wadden que els Delta Holandès. Aquesta relació sembla vàlida tan sols en femelles, mentre que en mascles és la inversa.

La fiabilitat de la identificació morfològica

L’anàlisi de components principals a partir de les dades morfològiques evidencia una bona separació específica pel que fa a les femelles (A) però no pas tan bona en mascles (B)

Tant l’anàlisi de components principals com la funció discriminant noten com, si bé les femelles de les dues espècies són ben diferenciades, en els mascles hi ha una considerable superposició. Així, a través d’aquestes funcions, la identificació específica de les femelles assoleix un nivell del 94-97%, mentre que en mascles aquest nivell baixa a 70-76%.

Els efectes de la conservació

Goedknegt et al. mostren com els espècimens es fan significativament més petits (un 17%) després d’haver estat guardats directament en etanol. Altres característiques, com la direcció i presència de les protuberàncies toràciques dorsolaterals, no s’hi veuen afectades.

Pel que fa a la congelació, aquesta no afecta a la mesura de longitud corporal. Ara bé, els espècimens que havien passat per un cicle de congelació-descongelació, en ésser traspassat a etanol, encongien encara més que els que hi havia estat dipositat en etanol en fresc.

Goedknegt et al. recomanen l’anàlisi genètica per confirmar l’espècie de mitícola

Goedknegt el al. han mostrat com cap caràcter diagnòstic macroscòpic, ni la combinació de dos o tres caràcters, permet una distinció diagnòstica acurada entre M. intestinalis i M.orientalis. La taxa d’error en femelles és baixa, del 7%, però no negligible. En mascles, a més, arriba al 25%. Aquestes estimacions, fins i tot, podrien ser un càlcul generós, si atenem a que es basen en observacions d’una única investigadora especialitzada.

Sobre el paper, però, les dues espècies semblen ben diferents. Goedknegt et al. es demanen si el que passa és que als Països Baixos, on totes dues espècies coexisteixen, hi ha una certa convergència morfològica. Al capdavall, les condicions de la Mar del Japó (d’on és originària M. orientalis) i la Mar Mediterrània (d’on prové M. intestinalis) són diferents entre elles. La simpatria comporta viure sota unes mateixes condicions ambientals. A més, Goedknegt et al. observaren una ostra que era parasitada simultàniament per M. intestinalis i M. orientalis, amb la qual cosa no es pot descartar que puguin hibridar (com podrien indicar també alguns resultats de la prova de RFLP-COI d’aquest estudi). Goedknegt et al., però, no consideren que la hibridació sigui la causa d’una major convergència morfològica, i admeten que queda encara per confirmar que les poblacions originàries de les dues espècies siguin tan divergents com indicava la descripció de T. Mori en 1935.

El principal tret diagnòstic diferenciador és la direcció de les protuberàncies toràciques dorsolaterals. Per ell, sol aquest tret diagnòstic permet un encert en la classificació de les femelles del 87-97%, i del 70-76% dels mascles. L’angle caudal és un tret diferenciador en femelles, però no és pas gaire útil en mascles.

Goedknegt recomanen, doncs, centrar-se en la direcció de les protuberàncies per distingir les dues espècies, ja que, a més, aquesta característica no és afectada pel mètode de conservació (etanol o congelació). Per a la identificació molecular, en canvi, recomanen la preservació de mostres fresques en etanol, sense congelar-les prèviament.

En casos d’espècies de bivalves i de localitats on se sàpiga de la presència potencial d’aquestes dues espècies invasives de copèpodes mitícoles, Goedknegt recomanen la identificació molecular, en tant que més fiable que la determinació morfològica. En aquest article, a més, presenten els elements necessaris per fer aquesta identificació genètica.

Lligams:

Cryptic invasion of a parasitic copepod: Compromised identification when morphologically similar invaders co-occur in invaded ecosystems. M. Anouk Goedknegt, David W. Thieltges, Jaap van der Meer, K. Mathias Wegner, Pieternella C. Luttikhuizen. PLoS One 13:e0193354 (2018).

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: