Sota el nom de talassèmies es coneixen una sèrie d’hemoglobinopaties congènites i hereditàries que es troben en especial freqüència a les poblacions mediterrànies. La base d’aquestes malalties són mutacions en les cadenes proteiques que integren l’hemoglobina, i així hom distingeix entre l’alfa-talassèmia (que afecta l’alfa-globina) i la beta-talassèmia (que afecta la beta-globina). En general, cal distingir entre les formes severes (talassèmia major) de les més lleus (talassèmia minor), que en part es poden atribuir al fet que en els primers la mutació es troba en homozigosi i en els segons la mutació es troba en heterozigosi. Les alteracions resultants en el glòbul vermell o eritròcit confereixen al portador no tan sols trets negatius, sinó també alguns trets positius, com ara una major resistència a la malària o paludisme. De fet, hom creu que la pressió selectiva favorable a la talassèmia minor en regions amb alta incidència de malària, explicaria l’alta prevalença en els països mediterranis. Els grups de recerca de Marianna H. Antonelou, del Departament de Biologia de la Universitat Nacional i Kapodistriana d’Atenes, i d’Angelo D’Alessandro, del Departament de Bioquímica i Genètica Molecular de la University of Colorado s’han demanat si el perfil hematològic únic de les persones amb beta-talassèmia minor es tradueix en una major capacitat dels seus eritròcits per suportar l’estrès associat a l’emmagatzematge en un banc de sang. En una recerca, encapçalada per Vassilis L. Tzounakas i Alkmini T. Anastasiadi, que apareix a la revista Haematologica, emmagatzemaren en fred eritròcits procedents de 18 donants amb beta-talassèmia minor. Comparant-los amb controls, analitzaren variables de qualitat primària (hemòlisi) i secundària (exposició a fosfatidilserina, pèrdua de potassi, estrès oxidatius), i de metabolòmica. En general, les unitats procedents de donants amb beta-talassèmia minor presentaven uns millors nivells de qualitat primària, i una major resistència estrès osmòtic, oxidatiu i mecànic. Per a emmagatzematges perllongats, també mostraven un perill més favorable en termes de senyalització superficial i de resistència al dany oxidatiu de components de la membrana. En el sobrenedant de la unitats s’hi detectava una menor acumulació de potassi i s’hi registrava una major capacitat antioxidant dependent d’urat. L’anàlisi metabolòmica evidenciava alteracions en les rutes metabòliques de purines i arginina ja en la línia de base, així com una activació de la via de pentoses fosfats i de la ruta glicolítica prèvia a la piruvat-cinasa. Al llarg de l’emmagatzemats, hi ha canvis addicionals en el metabolisme de l’arginina, de les purines i de vitamina B6, i en la via de l’hexosamina. L’alt nivell de generació de glutamat s’associa amb baixos nivells dels productes d’oxidació de les purines, com l’IMP, la hipoxantina i l’al·lantoïna. Totes aquestes dades fan pensar que els eritròcits d’aquests donants experimentarien una bona recuperació ulterior a la transfusió, i Tzounakas et al. creuen que convindria estudiar-ho posant a atenció l’augment d’hemoglobina i d’altres paràmetres clínics en receptors d’aquesta sang.
L’hemoglobina és el pigment responsable del transport d’oxigen en la sang, formada per un heterotetràmer, amb dues subunitats d’alfa-globina i dues de beta-globina. L’hemoglobina viatja en la sang dins d’uns corpuscles especialitzats: els glòbuls vermells (també coneguts com a eritròcits o hematís).
L’emmagatzematge d’unitats de sang per a transfusió
Vassilis L. Tzounakas i Alkmini T. Anastasiadi, del Departament de Biologia de la NKUA d’Atenes, són els primers autors d’aquesta recerca. L’estudi fou dissenyat per Tzounakas i la cap de grup, Marianna H. Antonelou. L’article fou redactat per Tzounakas, Anastasiadi, Antonelou i Angelo D’Alessandro (de la University of Colorado). Els experiments fisiològics i bioquímics foren realitzats per Tzounakas, Anastasiadi i Anastasios G. Kriebardis (del Departament de Ciència Biomèdica de la Universitat d’Àtica Occidental, a Egaleo). Les anàlisis metabolòmiques foren conduïdes per Davide Stefanoni, Francesca Cendali, Lorenzo Bertolone i Fabia Gamboni, de la University of Colorado. Monika Dzieciatkowska, també de UCol, realitzà els experiments proteòmics. Antonelou i Pantelis Rousakis (NKUA) feren les anàlisis de citometria de flux. Tzounakas, Anastasiadi, Antonelou i D’Alessandro analitzaren les dades. La resta d’autors aportaren expertesa o organitzaren el recrutament de participants. La recerca fou finançada per la Fundació Hel·lènica de Recerca Innovació i el Secretariat General de Recerca i Tecnologia. Els autors tenen paraules d’agraïments per tots els donants de sang que participaren voluntàriament en aquest estudi.
La qualitat d’emmagatzematge d’eritròcits en el context de la donació de sang fa referència al grau d’hemòlisi en el moment previ a la transfusió i a la recuperació dels eritròcits al capdavall de 24 hores després de la transfusió. En aquesta qualitat hi influeix factors propis del donant (edat, sexe, estil de vida), que tenen un impacte sobre el metabolisme energètic i l’estat redox dels eritròcits durant l’emmagatzematge en el banc de sang.
És sabut, per exemple, que una eritroenzimopatia com la deficiència en la glucosa-6-fosfat deshidrogenasa (G6PD) es manifesta en un major estrès oxidatiu dels eritròcits durant l’emmagatzematge.
En el cas de les persones portadores d’un al·lel beta-talassèmic, hom detecta alteracions en la síntesi de globina i, en general, una menor supervivència dels eritròcits, però molt habitualment no hi ha cap manifestació clínica, de tal manera que aquestes persones poden ésser donants de sang. En la població mundial vora un 5% són portadors de gens de talassèmia, i aquest percentatge augmenta especialment en el cas de la beta-talassèmia en països mediterranis com Grècia. És això el que conduí a Tzounakas i Antonelou a estudiar l’emmagatzematge i recuperació post-transfusional d’eritròcits d’aquestes persones.
Els eritròcits βThal+ presenten uns índexs diferents als de la població general, i una composició diferent de variants d’hemoglobina. A més, hi ha canvis en l’estructura de membrana, que es manifesten en una menor deformabilitat i en alteracions dels bescanvi iònic. L’alteració en l’hemoglobina es manifesta en una major presència del grup hem, el grup prostètic de l’hemoglobina portador de ferro i al qual s’associa reversiblement l’oxigen diatòmic, la qual cosa fa els eritròcits βThal+ més susceptibles a l’estrès oxidatiu, la qual cosa pot afectar proteïnes esquelètiques i lípids de membrana. Potencialment, aquests factors conduirien teòricament a una menor capacitat d’emmagatzematge en els bancs de sang i a una inferior recuperació post-transfusió.
D’altra banda, les alteracions en la membrana dels eritròcits βThal+ els fa potencialment més resistents osmòticament i menys agregables. Tzounakas et al. es demanaven quin seria el resultat global d’aquests fenòmens contradictoris.
Divuit donants βThal+ i vint donants control
En l’estudi in vivo s’utilitzà sang venosa de 204 donants habituals de sang, que es recollita en tubs amb anticoagulants (EDTA i citrat). D’aquests donants, se seleccionaren 38, dels quals 18 eren βThal+, per fer l’estudi d’emmagatzematge en CPD (citrat-fosfat-dextrosa)/SAGM (salí-adenina-glucosa-manitol) durant 42 dies a 4 °C. En la selecció d’aquests 38 donants es prengué cura que tots dos grups fossin els més semblants possibles en el perfil de sexe, edat, freqüència de donació i d’altres variables demogràfiques. La beta-talassèmia era confirmada per electroforesi d’hemoglobina i per la identificació molecular mutacions. Tots els donants signaren el consentiment informat sobre la natura de l’estudi.
Els nivells d’hemoglobina lliure eren mesurats per espectrofotometria. L’hemòlisi induïda osmòticament es feia exposants eritròcits a solucions de NaCl de concentració creixent, obtenint-ne la fragilitat corpuscular mitjana (la concentració de NaCl que produeix el 50% d’hemòlisi). L’índex de fragilitat mecànica era determinat per l’hemoglobina alliberada després d’agitar eritròcits amb perles d’acer inoxidable durant 1 hora. L’hemòlisi oxidativa s’estudiava a través d’una exposició a 17 mM de fenilhidrazina durant 1 hora. Les espècies reactives d’oxigen i l’acumulació de calci es mesuraven per fluorimetria. L’activitat antioxidant extracel·lular i la peroxidació lipídica es determinaven espectrofomètricament. L’exposició a fosfatidilserina s’estimava per citometria de flux multicolor. La carbonilació de proteïnes de membrana s’avaluava per Western blot.
L’anàlisi de proteòmica preliminar es feia a través d’una digestió FASP prèvia a la nano-UHPLC-MS/MS. Les anàlisis metabolòmiques es feien durant l’emmagatzematge amb una freqüència setmanal.
L’anàlisi estatística utilitzà el test de Shapiro-Wilk, test de t independent, anàlisis de variança i de correlació.
Els eritròcits βThal+ presenten una major emmagatzemabilitat
En la cohort de 204 donants elegibles de sang, el subgrup βThal+ representava el 9%, una xifra, doncs, gens menyspreable, i bastant representativa de la situació a Grècia. En aquestes persones hi ha una menor concentració d’hemoglobina, i uns índexs hemàtics inferiors, que són compensats en part amb un major recompte d’eritròcits i més concentració d’HbA2. En els 18 βThal+ s’hi detectaven cinc mutacions diferents (IVS I-1, IVS I-6, IVS I-110, IVS II-1 i IVS II-745), totes elles en el gen de la beta-hemoglobina. La fragilitat osmòtica dels eritròcits βThal+ era inferior als controls, i els nivells d’hemoglobina lliure eren semblants. De fet, en el plasma de donants βThal+ s’hi trobava una tendència a una major capacitat antioxidant total i, de retruc, un menor índex de carbonilació de proteïnes plasmàtiques.
Durant tot el període d’emmagatzematge, els eritròcits βThal+ mostraven una major resistència a l’hemòlisi mecànica i osmòtica. En les darreres dues setmanes dels 42 dies, a més, l’hemòlisi basal i l’hemòlisi oxidativa eren inferiors.
En el sobrenedant d’eritròcits βThal+ s’hi registrava una major capacitat antioxidant total, i una major capacitat antioxidant dependent de l’àcid úric. Aquesta diferència sembla associada a l’àcid úric, i es manifesta en una valors inferiors de peroxidació lipídica i de carbonilació proteica en les membranes dels eritròcits.
El perfil proteòmic i metabolòmic
L’aproximació òmica a aquestes diferències pot ajudar a destriar les causes moleculars subjacents. L’anàlisi proteòmica indica diferències en l’expressió en la membrana eritrocitària de proteïnes com la calmodulina, la calpaïna i l’annexina A7/sinexina.
L’anàlisi metabolòmica indica que en els eritròcits βThal+ hi ha un augment dels metabòlits derivats de la glucòlisi i de les vies metabòliques que se’n deriven. També es remarcable l’alteració en el metabolisme de les purines, el producte darrer del qual és l’àcid úric. Tot i que en humans no hi ha uricasa, l’àcid úric per oxidació química dóna lloc a al·lantoïna i al·lantoat: mentre la primera baixa en eritròcits βThal+ en el decurs dels 42 dies d’emmagatzematge la segona puja.
Resulta remarcable, en tot cas, que Tzounakas et al. hagin trobat que els eritròcits de donants amb beta-talassèmia minor presentin una millor emmagatzemabilitat. La raó d’això obeiria a un conjunt de factors bioquímics i metabòlics. Aprofundir en aquests factors ajudaria també en el disseny de noves estratègies d’emmagatzematge de sang i d’hemoderivats. Tzounakas et al. posen l’exemple concret de la criopreservació amb un pas previ de desglicerolització, que exigeix uns eritròcits resistents a la lisi hipoosmòtica.
Lligams:
– β-thalassemia minor is a beneficial determinant of red blood cell storage lesion. Vassilis L. Tzounakas, Alkmini T. Anastasiadi, Davide Stefanoni, Francesca Cendali, Lorenzo Bertolone, Fabia Gamboni, Monika Dzieciatkowska, Pantelis Rousakis, Athina Vergaki, Vassilis Soulakis, Ourania E. Tsitsilonis, Konstantinos Stamoulis, Issidora S. Papassideri, Anastasios G. Kriebardis, Angelo D’Alessandro, Marianna H. Antonelou. Haematologica (2021)
Des de la Mediterrània 