La metilació en quaranta-quatre llocs CpG s’associa amb la severitat clínica de la covid-19 (Epigenòmica mediterrània, 15/2021)

Des del punt de mira genòmic, l’atenció mediàtica sobre la covid-19 se centra en les variants del SARS-CoV-2, i les seves mutacions (com fan a outbreak.info). D’altres esforços investiguen, no pas la genòmica del virus, sinó la genòmica de l’hoste, és a dir els factors genètics al darrera de la susceptibilitat a la infecció per SARS-CoV-2 (com fan a The COVID-19 Host Genetics Initiative). Més enllà de la seqüència genètica, bé del virus o bé de l’hoste, hi ha les modificacions reversibles de l’ADN, com ara les metilacions. En aquest cas entrem en l’àmbit de l’epigenòmica. Aquesta setmana a EBioMedicine apareix un article encapçalat per Manuel Castro de Moura i Veronica Davalos, dels grups de recerca d’Aurora Pujol i Manel Esteller, en el qual es compara l’estatus de metilació de 850.000 llocs CpG de tot el genoma de mostres de sang perifèrica de 407 pacients confirmats de covid-19, dels quals 194 patiren una forma lleu que no requerí ingrés hospitalari i 213 tingueren un curs clínic sever que exigí suport respiratori. Dels 850.000 llocs CpG examinats, n’hi ha 44 que mostren una associació amb la severitat clínica de la covid-19, és a dir que mostres diferències entre els 194 malalts lleus i els 213 malalts greus. D’aquests 44, n’hi ha 23 situats en 20 gens codificants anotats. Entre aquests 20 gens hi ha l’AIM2 i gens candidats HLA-C i, en general, semblen implicats en la resposta d’interferó a la infecció viral. Zhang et al. (2020) ja havien observat en pacients crítics de covid-19 una especial prevalença d’errors congènits en la immunitat basada en l’interferó de tipus I. La perspectiva epigenètica d’Esteller ajuda a definir una signatura de metilació d’ADN associada a la severitat de la covid-19, i que podria servir en l’orientació dels programes de vaccinació, d’una banda, i també a la selecció de dianes terapèutiques per al desenvolupament de tractaments específics.

La signatura EPICOVID serviria per distingir, en una persona infectada per SARS-CoV-2, la propensió a seguir un curs asimptomàtic o paucisimptomàtic, o bé a seguir un curs sever.

Epigenòmica de susceptibilitat a una forma greu de covid-19

Aquesta recerca ha estat finançada per la campanya Imparables de la Fundació Josep Carreres, la Fundació Cellex i el Programa CERCA de la Generalitat de Catalunya. Esteller i d’altres dels investigadors participants treballen a l’Institut de Recerca Contra la Leucèmia Josep Carreras. L’experiència adquirida en els estudis d’epigenòmica, particularment de metilació d’ADN, sobre la leucèmia l’aplicaren a la covid-19. Ja en les primeres setmanes d’investigacions sobre la covid-19, s’havia posat de manifest la distinció entre la majoria d’infeccions (de curs lleu o, fins i tot, asimptomàtic) i les infeccions greus, que són les responsables de l’enorme càrrega de la covid-19 en termes de morbilitat i mortalitat. Entre els factors de risc associats a la severitat de la covid-19 es descrigueren aviat l’edat, el sexe masculí i comorbiditats com la diabetis, l’obesitat o la hipertensió. Més endavant, s’identificaren factors genètics, com el grup sanguini A o errors innats en la immunitat d’interferó de tipus I.

El 15 de març, ara fa un mes, els autors repassaven a Pubmed els articles publicats en llengua anglesa sobre “COVID-19”, “severity”, “respiratory failure”, “EWAS”, “epigenomics”, “DNA methylation”, “biomarker” i “prediction”. No hi trobares res, de forma que dedueixen que aquet és el primer estudi d’associació de tot l’epigenoma (EWAS, en l’acrònim anglès) sobre la severitat de la fallida respiratòria en la covid-19. L’endemà, dia 16, el trameteren a EBioMedicine, revista publicada per The Lancet. Era la versió revisada de l’article que havien tramès el 5 de gener. Aquesta vegada, a data de 26 de març, l’article fou acceptat, i publicat el 15 d’abril.

La metilació de l’ADN és el tret epigenòmic més ben estudiat. Sota el nom d’epigenètica s’inclouen, però, tots els canvis en la funció genètica que no impliquen una alteració de la seqüència d’ADN. No obstant, l’epigenètica és, si més no, parcialment heretable, i constitueix un tret identificador de l’individu. Biomarcadors epigenètics, particularment la metilació d’ADN identificada en sang perifèrica, són utilitzats activament en oncologia. L’ADN de sang perifèrica, d’altra banda, reflecteix particularment característiques de les cèl·lules immunitàries, que participen en el control d’infeccions i de tumors.

Mostres de sang procedents de 14 hospitals d’Espanya

Les mostres de sang i les dades clíniques dels 407 pacients amb covid-19 confirmada que foren utilitzades en aquest estudi procedien de 14 hospitals d’Espanya. És, en aquest sentit, un estudi retrospectiu. Els materials foren recollits entre el 7 de març i el 14 de setembre del 2020, de manera que reflecteixen la primera i segona onades, quan dominaven les variants originàries de SARS-CoV-2.

Per a la selecció de pacients es tingueren en compte criteris d’inclusió i d’exclusió. Eren criteris d’exclusió: obesitat amb un índex de massa corporal igual o superior a 30, diabetes, hipertensió, malalties autoimmunes, malaltia cardiovascular crònica, malaltia pulmonar crònica, tabaquisme, edat superior a 61 anys.

D’acord amb les guies del NIH, els pacients foren categoritzats en dos grups:
a) els asimptomàtics o paucisimptomàtics que no foren hospitalitzats (Grup G3)
b) els qui requeriren hospitalització i, a més, teràpia d’oxigen (màscara nasal o ventilació no-invasiva, oxigen d’alt flux. (Grup G2)
c) els qui requeriren hospitalització i, a més, ventilació mecànica, suport orgànic addicional (vasopressors) o oxigenació per membrana extra-corpòria (Grup G1).

La cohort sencera quedà dividida en cohort de descoberta (207) i cohort de validació (200).

Tot i ésser un estudi retrospectiu, d’acord amb el protocols aprovats pels comitès ètics de les institucions participants, s’obtingué consentiment informat de tots els pacients inclosos.

InfiniumMethylationEPIC Array i anàlisis bioinformàtiques

Aquest array d’Illumina fou l’utilitzat per valorar l’estatus de metilació d’ADN de les mostres de sang. En total queden coberts 850.000 llocs CpG (és a dir, citosina seguida de guanina en el sentit 5’-3’ de la cadena polinucleotídica) de tot el genoma humà. Com a genoma de referència s’utilitzà el GRCh37-hg19. L’estatus de metilació era validat addicionalment per piroseqüenciació.

Sobre les dades obtingudes de la cohort de descoberta es derivà un model lineal, ajustat per edat i sexe. Les CpG que mostraven un valor P ajustat per Benjamini-Hochberg inferior a 0,05, i una diferència absoluta en metilació superior a 0,10 foren seleccionades per a anàlisi ulterior.

Els gens en els quals es trobaven les CpG seleccionades foren examinats d’acord amb els termes de Gene Ontology.

Amb un model de classificació supervisada basat en la combinació de sis algoritmes d’aprenentatge (rf, adaboost, earth, knm, svmRadial, glmnet) es feien prediccions sobre l’estatus de la covid-19, bé cap a la forma asimptomàtica/paucisimptomàtica o cap a la forma severa.

Metilació d’ADN i forma severa de covid-19: 51 llocs CpG amb metilació diferencial

Els 407 pacients inclosos en aquest estudi eren, doncs, tots majors d’edat i menors de 61 anys, i no presentaven cap dels factors de risc associats típicament a les formes severes de covid-19. Foren dividits en dues cohorts similars, la de descoberta (207) i la de validació (200). No obstant, cal dir, que el percentatge de persones originàries d’Amèrica Central i del Sud era superior en la cohort de validació (33%) que no pas en la cohort de descoberta (18%).

L’extracció d’ADN de les mostres de sang funcionà en tots 407 casos. També en tots 407 casos s’aconseguí la hibridació amb cadascun dels 850.000 micropous de l’array.

Hom distingia entre les pacients asimptomàtics/paucisimptomàtics (Grup G3) dels qui requeriren teràpia d’oxigen en hospital (Grups G2 i G1).

En la cohort de descoberta (207 pacients), s’identificaren 51 llocs CpG (dels 850.000 analitzats!) que presentaven un estatus de metilació diferencial entre els pacients lleus (104) i els pacients severs (103). Com que en aquesta mateixa cohort hom trobava que els homes tendien a un pitjor curs clínic que les dones, s’aplicà una correcció per sexe a l’anàlisi. També hi havia una diferència en el curs clínic per grups d’edat, de manera que els més grans (tot menors de 61 anys, no obstant) tendien a un pitjor curs clínic que els més joves. Així doncs, s’aplicà addicional una correcció per edat.

La correcció per sexe i edat disminuí el nombre de CpG identificats de 51 a 44. Els set descartats, possiblement, eren més associats al sexe o l’edat que no pas realment al pronòstic de malaltia.

Els 44 llocs CpG (punts negres) i els gens associats (quadre blanc) distribuïts en els 22 cromosomes

Dels 44 llocs CpG, n’hi havia 15 localitzats en regions del genoma on no hi ha cap seqüència gènica descrita en l’actualitat. N’hi havia 6 associats a locus que generen ARN que no es tradueixen a proteïna. Els 23 llocs CpG restants es localitzen en 20 gens codificants diferents. Hi havia tres gens que presentaven 2 CpG amb metilació diferencial: AIM2, HLA-C i PM20D1.

A través d’una col·lecció de 62 línies cel·lulars derivades de sang en les que s’ha caracteritzat la relació entre la metilació d’ADN i els patrons d’expressió, resulta que en 17 d’aquests 20 gens, la hipermetilació en la regió 5’ reguladora condueix a una depressió de la transcripció.

Els 20 gens candidats, d’acord amb les bases de dades, s’associen a processos biològics com la “resposta immune”, la “via de senyalització de l’interferó de tipus I”, “la via de senyalització mitjançada per l’interferó gamma”, el “processament i presentació d’antigen”, “la resposta de defensa front a virus”, “la via senyalització mitjançada per citocines” i la “resposta inflamatòria”. Tots aquests termes GO semblen ben associats a una infecció vírica.

Dels 20 gens, 7 serien efectors de la senyalització d’interferó: AIM2, HLA-C, IFI44L, CXCR2, KIFAP3, SGMS1 i VIM. L’interferó és un dels elements claus del sistema immunitari contra infeccions víriques. En el cas d’AIM2 i HLA-C trobem dos CpG amb metilació diferencial.

El gen PM20D1 ha estat associat malalties metabòliques (obesitat, diabetis) i neurodegeneratives (Parkinson, Alzheimer). Codifica per una peptidasa.

Hi ha tota una sèrie de gens que brillen per absència en aquesta llista de 20 gens: ACE2, TMPRSS2, TICAM1/TRIF, UNC93B1, TRAF3, TBK1, IRF3, NEMO/IKBKG, IFNAR1, IFNAR2, STAT1 i STAT2.

El valor predictiu d’EPICOVID

La cohort de validació serveix per estimar el valor predictiu dels senyals de metilació. De les 44 CpG identificades en la cohort de descoberta, 37 s’associaven significativament també amb la severitat de la covid-19 en la cohort de validació. Aquests 37 CpG es localitzaven en 19 dels 20 gens referits abans.

La signatura EPICOVID, que combina les dades de 44 CpG, prediu la severitat de la covid-19 amb un 90,18% de precisió. La signatura EPICOVID+ s’associa amb els casos severs amb una especificitat del 88,18% i una sensibilitat del 77,78%. Aquesta associació també s’observa amb marcadors de laboratori clínic: IL-6, CRP, ferritina, fibrinògen, D-dímer i comptatge total de limfòcits.

L’especificitat de la signatura EPICOVID fou comprovada també en altres bases de dades: no se la troba enriquida en altres processos patològics: tuberculosi, malaltia pulmonar obstructiva crònica, asma, al·lèrgies respiratòries, artritis reumatoide, esclerosi múltiple, lupus sistèmic eritematós, etc.

Per a 21 llocs CpG, s’han validat les dades obtingudes de nivells de metilació per un mètode de piroseqüenciació. Aquesta podria ser la base d’un mètode d’anàlisi de la signatura factible en laboratoris hospitalaris.

La signatura EPICOVID en 338 individus sans

Els autors aplicaren la signatura EPICOVID a mostres de sang de 338 individus sans majors d’edat i menors de 61 anys. Eren mostres anteriors a l’aparició de la covid-19, de manera que es garanteix que eren individus no exposats al virus. De les 338 mostres analitzades, 45 mostren la signatura EPICOVID+ (el 13,3%).

El desenvolupament d’una tècnica de detecció de la signatura EPICOVID+ seria valuós en el control de la pandèmia. Permetria, per exemple, una estratificació primerenca dels casos detectats d’infecció de covid-19 en cribatges o arran de l’aparició de primers símptomes. Alhora, podria ajudar a identificar el segment de la població que, per raó epigenètica, es beneficiaria més de la vaccinació.

Lligams:

Epigenome-wide association study of COVID-19 severity with respiratory failure. Manuel Castro de Moura, Veronica Davalos, Laura Planas-Serra, Damiana Alvarez-Errico, Carles Arribas, Montserrat Ruiz, Sergio Aguilera-Albesa, Jesús Troya, Juan Valencia-Ramos, Valentina Vélez-Santamaria, Agustí Rodríguez-Palmero, Judit Villar-Garcia, Juan P. Horcajada, Sergiu Albu, Carlos Casasnovas, Anna Rull, Laia Reverte, Beatriz Dietl, David Dalmau, Maria J. Arranz, Laia Llucià-Carol, Anna M. Planas, Jordi Pérez-Tur, Israel Fernandez-Cadenas, Paula Villares, Jair Tenorio, Roger Colobran, Andrea Martin-Nalda, Pere Soler-Palacin, Francesc Vidal, Aurora Pujol, Manel Esteller. EBiomedicine (2021)

Epigenome-Wide Association Study of COVID-19 Severity with Respiratory Failure, a la base de dades de Gene Expression Omnibus.

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: