Els microsimbionts dels nòduls radicals del roldor d’Algèria (Microbiologia mediterrània, 44/2022)

El roldor és una planta arbustiva present en bardisses de banda i banda de la Mediterrània Occidental. És una planta d’interès en la prevenció de l’erosió de sòls. Els nòduls de les seves arrels acullen una comunitat d’espècies actinorizals del gènere Frankia. El grup de recerca de Maher Gtari, de l’Institut Nacional de Ciències i Tecnologia Aplicades, de la Universitat de Cartago, a Tunísia, especialitzat en bacteriologia molecular i genòmica s’ha ocupat dels microsimbionts de nòduls radicals de poblacions de roldor de l’Algèria mediterrània. En un article publicat a la revista Microbiology Insights amb Abdellatif Gueddou com a primer autor han aplicat una PCR a la detecció i seqüenciació del gen de la glutamin-sintetasa 1 (glnA1). Aquesta aproximació ha estat més fecunda que les tècniques d’aïllament en cultiu, on tan sols havien pogut detectar soques de Frankia asimbiòtiques i altres actinobacteris (Micrococcus, Micromonospora, Nocardia, Pantactinospora i Streptomyces). Gueddou han obtingut 12 seqüències diferents del gen glnA1, de les quals 9 no eren descrites en les bases de dades.

Els fruits del roldor són verinosos

Els nòduls radicals del roldor

L’estudi fou dissenyat per Maher Gtari, del Grup de Bacteriologia Molecular i Genòmica de l’Institut Nacional de Ciències Aplicades i de la Tecnologia de la Universitat de Cartago. La recollida de mostres de nòduls de roldor fou realitzada per Abdellatif Gueddou (Universitat de Cartago), Moussa Louati (Cartago) i Hafsa Cherif-Silini (del Grup de Microbiologia Aplicada de la Universitat Ferhat Abbas Alegria, de Sétif). Els experiments foren conduït per Gueddou, Imed Sbissi (del Grup d’Ecologia Pastoral de l’Institut de Regions Àrides de Médenine) i Faten Ghodhbane-Gtari (de la Universitat de Cartago i de l’Institut Superior de Biotecnologia de Sidi Thabet, adscrit a la Universitat la Manouba). Gtari redactà l’article, que fou aprovat després pels altres autors.

El roldor (Coriaria myrtifolia) és endèmic de la Mediterrània Occidental. Al nord del Magreb, com a la resta de l’àrea de distribució, se’l troba en bardisses i en les vores de boscos i barrancs. Els autors són tunisians, però el roldor no hi ha arriba, circumscrit als climes relativament temperats del Rif i dels subsectors litorals de l’Atles algerià. És sabut que el roldor és una planta actinorizal, que forma una associació simbiòtica amb espècies del gènere d’actinobacteris Frankia. Aquesta simbiosi permet que dins dels nòduls Frankia pugui dur a terme la fixació del nitrogen atmosfèric en formes de nitrogen que sí són aprofitables per a la planta.

Val a dir que no tota la diversitat del gènere Frankia estableix simbiosis amb plantes actinorizals com el roldor. Concretament en el cas del roldor, la simbiosi s’estableix amb un llinatge distintiu classificat dins de l’agregat 2 del gènere Frankia. Aquest llinatge també forma simbiosis amb altres plantes (Ceanothus, Datiscaceae i Dryadoideae).

Un bacteri fastidiós

A diferència d’altres actinobacteris, el clúster 2 del gènere Frankia és difícil o impossible de cultivar en el laboratori. Paradoxalment, altres membres del gènere Frankia, que ni formen nòduls ni fixen nitrogen, sí han pogut cultivar-se a partir de mostres d’arrels de Coriaria, Datisca o Ceanothus: es tracta de membres del clúster 4 del gènere.

El grup de Gtari, a través de tècniques de genòmica comparada i de bioassaigs fisiològics, ha estat pioner en la consecució de cultius axènics del clúster 2 de Frankia. En el treball publicat ara ho ha intentat sobre mostres de nòduls radicals de roldor de poblacions naturals d’Algèria. De tota manera són les tècniques moleculars aplicades al gen GlnA1 els que els han permès una descripció de la diversitat genètica d’aquests bacteris que, en essència, romanen com a incultivables.

Una mostra de 44 nòduls radicals

En aquest estudi, Gueddou et al. han fet servir un total de 44 nòduls radicals de roldor recollits en quatre localitats d’Algèria:
– 3 nòduls d’un roldor de Les Gorges de Kharrata, a Bejaia.
– 11 nòduls de dos roldors de Les Cascades de Kefrida, a Derguina.
– 12 nòduls de 3 roldors de La Plage de la Grotte Merveilleuse, a Jijel.
– 18 nòduls de 3 roldors de La Plage Rouge, de Ziama mansoria.

D’aquests 44 nòduls es processaren 833 lòbuls individuals. Per fer-ho primer es rentaven amb aigua de l’aixeta estèril, i després n’esterilitzaven la superfície amb peròxid d’hidrogen al 30%. L’efectivitat de l’esterilització era comprovada inoculat la darrera solució de rentat en plaques d’agar amb nutrients que eren incubades durant uns dies. Els nòduls que passaven aquesta darrera prova entraven en el protocol ulterior d’aïllament de microsimbionts en un medi BAP.

Una part dels lòbuls individuals esterilitzats era destinada a l’extracció d’ADN. També es feia extracció d’ADN dels cultius líquids de Frankia d’un mes d’edat, així com d’altres cultius d’actinobacteris crescuts en medi sòlid de Luedemann.

L’amplificació per PCR feia ús dels primers universals 5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ i 5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′ (corresponents al gen 16S rRNA) i dels primers 5′-TTCTTCATCCACGACCCG-3′ i 5′-GGCTTCGGCATGAAGGT-3′ per a l’amplificació d’un fragment de 477 nucleòtids del gen glnA1.

El test d’inoculació de roldor es fa amb llavors d’aquesta planta, recollides a Algèria i esterilitzades. Les llavors eren exposades a cèl·lules procedents de cultius de Frankia de quatre setmanes d’edat. Al cap de tres mesos es comprovava si les plàntules resultants tenien nodulació o no. Com a control positiu s’utilitzava la soca Frankia coriaria BMG5.1 i com a control negatiu aigua estèril.

Tan sols 3 aïllats de 833 lòbuls de nòduls radicals

És il·lustratiu que dels 833 lòbuls emprats per a l’aïllament de micosimbionts de Frankia tan sols s’hagin pogut assolir 3 aïllats en medi BAP. En tots tres casos són de nòduls procedents de La Plage de la Grotte. Aquests 3 aïllats produeixen hifes i esporangis, però no arriben a formar vesícules. Cap dels 3 aïllats és capaç de créixer en un medi BAP sense font de nitrogen. Tampoc cap dels 3 aïllats és capaç d’induir la formació de nòduls radicals en el laboratori. Les seqüències dels gens 16S rRNA i glnA1 indiquen que aquests tres aïllats s’integren dins del clúster 4 de Frankia.

La microscòpia de contrast de fase posa en evidència la formació d’hifes i esporangis en soques cultivables de “Frankia”

Dels 833 lòbuls incubats en medi BAP es van haver de descartar 160 que mostraven contaminacions de fongs i bacteris de ràpid creixement en qüestió de 2-5 dies. En altres lòbuls es detectà a través de la PCR del gen 16S la presència de micelis de Micrococcus, Micromonospora, Nocardia, Plantactinospora i Streptomyces.

Gueddou et al. han obtingut 24 seqüències del gen glnA1. Totes elles es correspondrien al clúster 2 de Frankia. Aquestes 24 seqüències es corresponen a 11 seqüències diferents. D’aquestes 11 seqüències n’hi ha 9 que no han estat descrites prèviament entre micosimbionts de roldor.

Les 11 seqüències s’estructuren en 3 subclústers. El més freqüent (62,5%) és present a tres de les quatre localitat mostrejades (Les Cascades de Kefrida, La Plage de la Grotte Merveilleuse i La Plage Rouge): aquest subclúster també ha estat detectat en estudis previs al Marroc, a Tunísia, a França o als Estats Units, associat a una diversitat de plantes (Datisca glomerata, Purshia tridentata, Cercocarpus betuloides, Cercocarpus ledifolius, Cercocarpus foliolosa, Ceanothus cuneatus, Ceanothus prostratus i Ceanothus integerrimus.

El segon subclúster (16,6%) és present a La Plage de la Grotte Merveilleuse i a La Plage Rouge, i ha estat descrit a França i Marroc (Coriaria myrtifolia), a Mèxic (Coriaria micophylla), a Pakistan (Coriaria nepalensis) i a Califòrnia (Cercocarpus betuloides, Datisca glomerata).

El tercer subclúster (16,6%) és present a Les Gorges de Kharrata i a Les Cascades de Kefrida, i ha estat també descrit a França i Marroc (Coriaria myrtifolia), a Japó (Coriaria japonica) i a Mèxic (Coriaria microphylla).

La diversitat dels microsimbionts dels nòduls radicals del roldor d’Algèria

La diversitat dels microsimbionts es pot resseguir amb els gens 16S rRNA o nifH, però Gueddou et al. consideren que és millor fer-ho amb el gen glnA1, que és més variable. Com en altres estudis semblants la diversitat de seqüències del gen glnA1 no es correspon a la diversitat geogràfica. Els tres subclústers detectats a Algèria són també presents en altres continents: com que allà no hi creix el roldor (que és un endemisme mediterrani) els trobem com a microsimbionts d’altres espècies del gènere Coriaria o fins i tot de plantes més allunyades filogenèticament. En aquest sentit, els subclústers detectats són cosmopolites i presenten un rang ample de plantes amb les que fan simbiosi.

Metodològicament, Gueddou et al. mostren l’especificitat d’una aproximació basada en l’amplificació i seqüenciació genètiques en aquest tipus d’organismes de difícil o impossible cultiu en el laboratori. Val a dir que aquesta tècnica també posa de manifest la presència en els nòduls radicals d’altres gèneres d’actinobacteris. Així doncs, actinobacteris diferents de Frankia poden contribuir a funcions com la fixació de nitrogen, la solubilització de fòsfor, la producció d’hormones, la generació de sideròfors o antagonismes contra fongs i insectes. Podríem sentir-nos impulsats a considerar els nòduls radicals com un exemple de comunitat simbiòtica complexa, però alhora Gueddou et al. assenyalen que, al capdavall, el clúster 2 de Frankia és el component essencial i característic dels nòduls.

Lligams:

– Root Nodule Microsymbionts of Native Coriaria myrtifolia in Algeria. Abdellatif Gueddou, Imed Sbissi, Moussa Louati, Faten Ghodhbane-Gtari, Hafsa Cherif-Silini, Maher Gtari. Microbiol. Insights 15: 11786361221133794 (2022).