Les vesícules extracel·lulars que emet el tegument de cucs paràsits posen en contacte el paràsit amb el seu hoste i amb la microbiota corresponent. Aquestes vesícules transporten a l’exterior material biològic del paràsit i poden constituir un factor de virulència. Els parasitòlegs, doncs, contemplen les vesícules extracel·lulars com una diana de tractaments profilàctics o terapèutics. Itziar Estensoro, del Grup de Patologia de Peixos de l’Institut d’Aqüicultura Torre de la Sal, de Ribera de Cabanes, ha coordinat una recerca sobre les vesícules extracel·lulars que secreta el cuc microcotílid Sparicotyle chrysophrii, un paràsit hematòfag de les brànquies de l’orada (Sparus aurata) que produeix pèrdues a les piscifactories de la Mediterrània. En un article a la revista Parasites & Vectors, amb Enrique Riera-Ferrer com a primer autor, exposen la biogènesi, ultraestructura i proteòmica d’aquests orgànuls extracel·lulars. El punt de partida de la recerca foren les bases de dades genòmiques d’altres platelmints (Clonorchis spp., Echinococcus spp., Fasciola spp., Fasciolopsis spp., Opisthorchis spp., Paragonimus spp. i Schistosoma spp.). Paral·lelament investigaren amb microscòpia electrònica de transmissió espècimens adults de S. chrysophrii. Amb un protocol de cromatografia acoblada a espectrometria de masses, sobre un pool de 200 exemplars adults de S. chrysophrii, isolaren, purificaren i caracteritzaren vesícules extracel·lulars. Riera-Ferrer et al. han identificat 59 proteïnes implicades en la biogènesi d’ectosomes en la capa sincitial de la regió haptoral de les pinces de S. chrysophrii. Les nanopartícules purificades tenen un diàmetre mitjà de 251,8 nm. A dins hi ha pèptid-hidrolases, GTPases i proteïnes de domini de ma EF, així com proteïnes identificades en la patogènesis parasitària. És la primera vegada que s’estudia amb detall les vesícules extracel·lulars d’un platihelmint ectoparàsit, i això obre oportunitats per a trobar fàrmacs que previnguin o curin aquesta helmintiasi de l’orada.
Microimatges de la capa sincitial que recobreix les pinces de ‘Sparicotyle chrysophrii’ obtingudes per Riera-Ferrer et al. il·lustren la biogènesi i estructura de les vesícules extracel·lulars.
Un platihelmint ectoparàsit de l’orada
La presa de mostres i experiments foren realitzats per Enrique Riera-Ferrer (IATS, CSIC), Hynek Mazanec (del Laboratori d’Helmintologia de l’Institut de Parasitologia del Centre de Biologia de l’Acadèmia Txeca de Ciències, de České Budějovice), Ivona Mladineo (cap del Laboratori d’Helmintologia Funcional de České Budějovice), M. Carla Piazzon (IATS), Itziar Estensoro (IATS) i Javier Sotillo (del Centro Nacional de Microbiología de Majadahonda). Les dades foren tractades per Riera-Ferrer i Peter Konik (de la Universitat de Bohèmia Meridional, České Budějovice). L’anàlisi formal fou a càrrec de Riera-Ferrer, Mazanec, Mladineo, Konik, Piazzon, Estensoro i Sotillo. Les figuren foren fetes per Riera-Ferrer i Estensoro. El finançament fou aportat per Ariadna Sitjà-Bobadilla (IATS), Oswaldo Palenzuela (IATS), Sotillo i Roman Kuchta (BC CAS). Riera-Ferrer, Estensor i Sitjà-Bobadilla redactaren la major part de l’article, i tots els autors l’editaren i revisaren.
Els procediments foren aprovats pel comitè ètic del CSIC i comptaren amb el permís de la Generalitat Valenciana.
Els autors agraeixen a I. Vicente l’assistència tècnica en el manteniment de les orades i el mostreig. També agraeixen al personal del Centre de Biologia de l’Acadèmia Txeca de Ciències el suport en la microscòpia.
La recerca s’ha finançat amb fons del Ministeri espanyol de Ciència i Innovació, a través dels projectes SpariControl i ThinkInAzul, de la Generalitat Valenciana i de la Fundació Txeca de Ciència. L’article s’ha pogut publicar en obert per una iniciativa del CSIC.
L’article fou tramès a la revista el 22 de desembre del 2023, i fou acceptat el 21 de març del 2024.
La classificació dels cucs plans o platihelmints no es troba resolta. Aquest phyllum clàssicament s’ha dividit en turbel·laris, trematodes i cestodes. Els trematodes eren dividits al seu torn en monogenis i digenis. Actualment, però, els monogenis han estat repartits en dues classes diferenciades, els Monopisthocotyla i els Polyopisthocotyla. Totes dues classes entren en la categoria de neodermats, i en totes dues trobem paràsits aquàtics, principalment ectoparàsits. Algunes espècies tenen un important impacte negatiu en piscifactories.
Sparicotyle chrysophrii (Van Beneden & Hesse, 1863) és classificat actualment en la família dels Microcotylidae, adscrita als Polyopisthocotyla. És un dels patògens més amenaçadors per a l’orada de piscifactoria a la Mar Mediterrània.
Les secrecions dels monogenis paràsits han estat investigades com a factor de virulència, tant en la fracció soluble com vesicular. La secretòmica investiga els components d’aquestes secrecions, amb especial interès per les peptidases i inhibidors de peptidases. En la fracció vesicular de les secrecions trobem vesícules extracel·lulars. Les vesícules extracel·lulars es diferencien, segons el seu origen, en exosomes i ectosomes. Els exosomes es formen a través d’una via endocítica, dependent o no del sistema ESCRT. Entre els exosomes trobem vesícules intraluminals agregades en cossos multivesiculars. Els ectosomes es formen per la gemmació i escissió de la membrana citoplasmàtica, en un procés dependent de citoesquelet i de calci.
La maquinària de biogènesi de les vesícules extracel·lulars és compartida pels diferents grups de neoderms. Les vesícules actuen com a transportadors de biomolècules (proteïnes, lípids, àcids nucleics, glicans). El seu rol en la interacció entre paràsit i hoste els fa interessants en aplicacions pràctiques de prevenció i tractament.
Dos espècimens de ‘Sparicotyle chrysophrii’
Una estratègia per a caracteritzar les vesícules extracel·lulars
Riera-Ferrer et al. parteixen d’una base de dades de 82 seqüències de proteïnes implicades en la biogènesi de vesícules extracel·lulars de mamífers publicades a Uniprot. Amb tBLASTn hom investiga anàlegs d’aquestes seqüències en bases de dades genòmiques i transcriptòmiques de S. chrysophrii. També investigaren la presència d’homòlegs en bases de dades d’altres platihelmints.
A Torre de la Sal treballen amb un model experimental de parasitació de l’orada per S. chrysophrii. En aquest model el tanc de noves orades és exposat amb aigua procedent del tanc d’orades ja infectades. La pressió infectiva del model es modula amb recol·lectors d’ous. Per als experiments se sacrificaren cinc orades infectades: dels arcs branquials es recuperaren espècimens adults de S. chrysophrii. Un dels arcs branquials fou muntat per a examinar-lo posteriorment al microscopi òptic.
Tres espècimens adults de S. chrysophrii foren mantinguts in vitro en un medi de sèrum de pollastre. Els processaren per congelació a alta pressió i els destinaren a preparacions histològiques.
Dos-cents espècimens adults de S. chrysophrii foren destinats a la recol·lecció de vesícules extracel·lulars. Els cultivaren en plaques de 24 pouets (amb 10 paràsits per pouet) durant tres dies. Els sobrenadants, recollits cada dia, foren centrifugats seriadament, concentrats i processats per cromatografia. Amb la tècnica de Bradford hom seguia la concentració de proteïna de les diferents fraccions. Alíquotes resultants foren observades amb NanoSight.
Altres alíquotes dels extractes de vesícules extracel·lulars eren analitzades proteòmicament per LC-MS/MS. Les dades eren analitzades amb el programari MaxQuant/Andromeda, utilitzant les bases de dades recopilades pels investigadors. Les proteïnes detectades foren examinades en la base de dades funcional Revigo i en la base de dades enzimàtica ECPred.
59 proteïnes
De les 82 proteïnes esmentades, n’hi havia 59 que tenien homòlegs en el genoma de S. chrysphrii. Es pot deduir que a S. chrysphrii hi ha presència de via de biogènesi d’ectosomes.
L’evidència microgràfica
Les imatges de microscòpia òptica i electrònica indiquen la presència de vesícules extracel·lulars de 200 nm de diàmetre. Consistirien en una bicapa de material present en l’espai luminal de les pinces del cuc, bé lliures o bé adherides a la capa sincitial del tegument.
L’ultrastructura de la pinça consisteix en feixos d’orientació radial de miofilaments i mitocondris, estesos al llarg d’esclerites. La capa exterior del tegument (o neodermis) consisteix en un sinciti, és a dir en la fusió de cèl·lules epitelials, amb un gruix de 300 a 2500 nm. Dins del sinciti s’aprecien abundants vesícules de mides i densitats diferents, des de grànuls fins a grans vacuoles. El sinciti és important en la interacció de la pinça del paràsit amb els teixits lamel·lars de les brànquies del peix.
La purificació de vesícules extracel·lulars
La major recol·lecció de secreció es feia al segon dia de mantindre els cucs in vitro. La purificació permetia aconseguir nanopartícules que anaven de 50 a 900 nm.
La proteòmica de les vesícules extracel·lulars
En les vesícules extracel·lulars de S. chrysophrii, Riera-Ferrer et al. identifiquen 124 proteïnes. N’hi ha 18 que podrien participar en la biogènesi d’exosomes i ectosomes, entre elles 8 GTPases. N’hi ha 10 que serien xaperones, 11 implicades en el metabolisme energètic, 2 en la detoxificació, 17 en hidrolases i 1 en transport de ferro. Els processos metabòlics més ben representats serien el metabolisme energètic, la proteòlisi, la ubiqüitinació, la fosforilació de proteïnes i el plegament de proteïnes. També hi ha presència de processos d’organització de citoesquelet, d’exocitosi, de transport de ferro i de regulació negativa de la coagulació.
Entre les activitats enzimàtiques detectades hi ha la glutatió-transferasa, l’oxidoreductasa, la transferasa, la hidrolasa, la liasa, la isomerasa i la ligasa, així com peptidasa, unió a ferro, ferroxidasa, unió a proteïnes, unió a nucleòtids, GTPasa, etc.
Un retrat de les vesícules extracel·lulars de S. chrysophrii
La producció d’exosomes en S. chrysophrii es faria principalment per una ruta dependent de ESCRT. L’alliberament d’ectosomes seria regulat per petites GTPases Rab.
Les secrecions de S. chrysophrii poden arribar a una concentració de desenes de milions de nanopartícules per microlitre. La funció de les vesícules podria consistir en protegir el paràsit de les defenses de l’hoste, i també en la modulació d’algunes funcions de l’hoste com ara la coagulació de la sang. Riera-Ferrer et al. consideren interessant comprovar si les vesícules arriben a ser internalitzades per cèl·lules de l’orada.
Com a paràsit hematòfag, S. chrysophrii explota com a nutrient l’hemoglobina, la qual cosa requereix un ventall de peptidases. Les vesícules extracel·lulars podrien ajudar a la digestió exosomàtica de l’hemoglobina. En la digestió de l’hemoglobina és important eludir la toxicitat associada al grup hemo lliure, la qual cosa requereix una bona maquinària antioxidant i de quelació de ferro. L’homeostasi del ferro esdevé crítica, i les vesícules extracel·lulars hi contribuirien.
En l’actualitat els únics tractaments d’aquesta parasitosi de l’orada són el peròxid d’hidrogen i els banys de formaldehid. Cal trobar-hi alternatives i el coneixement de la fisiologia de les vesícules extracel·lulars podria ajudar-hi.
Lligams:
– An inside out journey: biogenesis, ultrastructure and proteomic characterisation of the ectoparasitic flatworm Sparicotyle chrysophrii extracellular vesicles. Enrique Riera-Ferrer, Hynek Mazanec, Ivona Mladineo, Peter Konik, M. Carla Piazzon, Roman Kuchta, Oswaldo Palenzuela, Itziar Estensoro, Javier Sotillo & Ariadna Sitjà-Bobadilla. Parasit Vectors 17: 175 (2024).
Des de la Mediterrània 