JM Mulet s’ha fet tan conegut com a divulgador i polemista en temes agroalimentaris que sovint s’obliden les aportacions del seu grup de recerca sobre biologia de l’estrès en plantes. Ahir, precisament, anunciava la publicació al Journal of Integrative Plant Biology d’un article, amb Patricia Benito com a primera autora, sobre una combinació de bioestimulant microbià i no-microbià per augmentar el rendiment de la lletuga sota condicions d’estrès salí. La combinació funcionaria a través d’una sobreregulació de la biosíntesi de citocinina. Tenen en ment ens problemes que ocasiona la salinització en l’agricultura, impulsada en part per l’escalfament global antropogènic. El concepte de bioestimulant abasta agents microbians (probiòtics) o extractes naturals i, a banda d’ésser acceptables per a l’agricultura convencional també són òptims per a l’agricultura orgànica o ecològica. El grup de Mulet considera tan important trobar bioestimulants adients com esclarir els mecanismes moleculars d’actuació, que caldria estudiar especialment en condicions el més properes possibles dels cultius reals. En aquest treball el bioestimulant consisteix en una aplicació combinada del bacteri Bacillus megaterium BM08 (un bacteri promotor del creixement de plantes) i d’un bioestimulant microbià. Analitzen els efectes de la bioestimulació en condicions d’irrigació normal i en condicions d’estrès salí. En tots dos casos hi ha un augment del rendiment del cultiu. Per conèixer-ne el mecanisme de la bioestimulació han estudiat paràmetres fisiològics com peroxidació lipídica, antioxidants, clorofil·les, els fenols totals i fitohormones, l’expressió de gens (seqüenciació d’ARN) i el metabolisme primari. El bioestimulant fa que la lletuga tingui una menor resposta antioxidant i que hi hagi una major expressió de gens implicats en la biosíntesi de la citocinina en condicions d’estrès salí. Això es manifesta en un augment de la concentració de la citocinina activa (la isopenteniladenosina) en arrels i en fulles, així com un augment en l’àcid gamma-aminobutíric (un aminoàcid no-proteic vinculat a resposta a l’estrès abiòtic). També es manifesta en una disminució d’àcid màlic, i una sobreexpressió de SR-cinases (per un mecanisme independent de l’àcid abscísic), enzims també implicats en resposta a l’estrès abiòtic. L’aplicació del bioestimulant no-microbià, per ella sola, desencadena una resposta sota l’estrès salí dependent de l’àcid abscísic. És en combinació amb el bioestimulant microbià, que potencia els mecanismes desencadenats pel bacil. La resposta dependent de citocina explicaria, si més no en part, l’augment de rendiment del cultiu d’enciam sota estrès salí per bioestimulació.
Un camp d’enciam a Califòrnia fotografiat en el 2005.
L’estrès salí en plantes
Aquesta recerca fou concebuda per Javier Bellón (Caldic Ibérica, S.L.), Lynne Yenush (IBMCP) i José M. Mulet (IBMCP). La metodologia ha estat dissenyada per Mulet i Rosa Porcel (IBMCP). El programari fou gestionat per Patricia Benito (IBMCP). La investigació fou conduïda per Benito, Marina Celdrán (IBMCP), Vicente Arbona (Universitat Jaume I, de Castelló), Miguel González-Guzmán (UJI) i Porcel. Bellón aportà recursos. La cura de dades fou a càrrec de Benito i Celdrán. La preparació de l’esborrany original fou realitzada per Benito i Mulet. En la revisió i edició posterior participaren Yenush, Porcel, Arbona i González-Guzmán. Mulet en fou supervisor. L’administració del projecte la feren Mulet i Benito. L’adquisició de fons la realitzaren Mulet, Benito i Porcel.
Els autors agraeixen Carlos Baixauli Soria i Alfonso Giner Martorell, de la Fundación Cajamar per l’assistència tècnica en l’assaig agronòmic. També agraeixen la tasca de la Plataforma Metabolòmica de IBMCP-UPV-CSIC. La recerca s’ha finançat en el marc del projecte de “Desarrollo de formulados bioestimulantes y biofertilizantes innovadores de origen natural (Calbio) destinados a la agricultura convencional y ecológica. Estudio científico de efectos sinérgicos entre bioactivos microbianos y no microbianos” entre Caldic Ibérica S.L. i l’UPV, així com en el projecte de “Modelo de evaluación de efectos de bioestimulantes en cultivos con condiciones de stress abiótico: escasez de agua y baja fertilización (MODELCALBIOSTRESS)” del Ministerio de Ciencia i el projecte “Evaluación del efecto beneficioso de la combinación de diferentes bioestimulantes comerciales (extractos de productos naturales y microbianos) bajo condiciones de estrés salino en plantas de interés agronómico” de l’UPV. Cap dels autors declara conflicte d’interès.
L’article fou tramès a JIPB el 17 de gener del 2024. L’edició anà a càrrec d’Ian T. Baldwin, del Max Planck Institute for Chemical Ecology. L’article fou acceptat després d’una revisió el 16 de juliol, i publicat el 7 d’agost.
Factors ambientals adversos afecten el creixement i desenvolupament de les plantes. Aquesta afectació és mitjançada en part per la resposta de les plantes a nivell fisiològic, bioquímic, metabolòmic i hormonal. Aquesta resposta contribueix a resistir l’estrès ambiental i a mantindre el programa de desenvolupament de la planta.
El canvi climàtic antropogènic, a través de l’escalfament global, fa que factors ambientals adversos siguin més freqüents i intensos, amb el consegüent impacte sobre els agroecosistemes. La salinitat del sòl és un d’aquests factors, i és especialment greu com a limitador de la producció agrícola. L’augment de la salinitat en sòls agrícoles pot ésser la conseqüència de l’erosió de minerals del sòl, baixes precipitacions o la intrusió d’aigua marina. També hi pot contribuir la irrigació extensiva. En àrees sotmeses a estrès hídric, l’aigua de regadiu sol presentar un elevat un contingut de sal, la qual cosa agreuja la situació. Segons el mapa de sòls afectats per la salinització de la FAO, aquesta afectació abasta més de 833 milions d’hectàrees. Cada any aquesta xifra creix en 1,5 milions d’hectàrees.
L’estrès salí és integrat per dos components:
– l’estrès osmòtic. Aquest es manifesta en l’acumulació de sals solubles en les arrels. L’augment consegüent del potencial osmòtic de la mèdia externa obstaculitza l’absorció d’aigua per les arrels
– l’estrès iònic. Aquest es manifesta en l’acumulació de ions sodi (Na+) en els teixits vegetals. Per evitar una acumulació de sodi excessiva en el citoplasma, hi ha una extrusió a les arrels o un transport i acumulació cap a les vacuoles de la part aèria de la planta.
L’estrès salí altera l’homeostasi iònica, afectant també els ions potassi (K+). L’acumulació citoplasmàtica de Na+ interfereix amb processos metabòlics i cel·lulars. La combinació d’estrès osmòtic i iònic redueix la turgència i la captació d’aigua, la qual cosa es manifesta en tancament d’estomes, reducció de la fotosíntesi i de l’activitat fisiològica, augment dels nivells d’espècies reactives de l’oxigen (ROS), reducció de l’absorció de minerals, etc.
En condicions d’estrès salí o osmòtic, les plantes responen amb l’acumulació de soluts osmoprotectius que ajudin a mantindre la turgència cel·lular. Són exemples de soluts osmoprotectius alguns sucres i alguns aminoàcids. Aquests compostos regulen el potencial osmòtic i salvaguarden estructures macromoleculars prevenint la captació de cations tòxics.
La reducció de l’eficiència fotosintètica per un estrès salí condueix a una reducció de l’activitat de la cadena de transport electrònic i a un augment de la formació de ROS com el peròxid d’hidrogen (H2O2) i l’anió superòxid (O2–). Aquesta producció excessiva de ROS indueix dany oxidatiu a pigments fotosintètics, i a orgànuls i a membranes cel·lulars. Per frenar-los hi ha tota una sèrie d’enzims antioxidants: superòxid-dismutasa (SOD), ascorbat-peroxidasa (APX), glutatió-reductasa (GR) i catalasa (CAT). També hi ha antioxidants no-enzimàtics: fenols, alcaloides, flavonoides i carotenoides.
Les fitohormones també tenen un rol en la resposta contra l’estrès. L’àcid abscísic (ABA) és sintetitzat ràpidament en resposta a vies de senyalització específiques. L’ABA modifica l’expressió gènica per respondre a l’eixutesa o a la salinitat. El nom d’abscísic fa referència al rol de l’ABA en la regulació de la senescència a través de l’abscissió d’òrgans específics. Però també participa en el tancament d’estomes.
Una altra fitohormona rellevant és la citocinina. Aquesta intervé en algunes plantes en la resposta a l’estrès salí a l’estrès per alta temperatura.
Els cultius d’horta són molt sensibles a la sequera i a la salinitat. Al capdavall, són plantes amb alta demanda d’aigua i força halòfobes. La lletuga o enciam (Lactuca sativa L.) és un cultiu hortícola glicofític d’alt valor econòmic. Els principals productors mundials són Xina i els Estats Units. Espanya és el principal productor d’enciam a Europa i a la Conca Mediterrània. L’enciam per a la nostra població és una font important de vitamines, carotenoides, antioxidants, àcid cafeic i flavonols.
N’hi ha prou amb una conductivitat elèctrica del sòl de 2 dS/m perquè comencin a aparèixer símptomes d’estrès salí en l’enciam. Quan la conductivitat puja encara més el cultiu d’enciam pateix una reducció de biomassa, una major presència de fulles cremades, fulles menys turgents, menor germinació de llavors, caiguda de l’eficiència fotosintètica, augment del sodi intracel·lular, augment de la concentració de ions clorur (Cl–) i major tendència a la peroxidació lipídica.
Una eina agronòmica per respondre a estressos abiòtics en cultius d’horta és l’ús de bioestimulants. Els bioestimulants són productes d’origen natural que estimulen el creixement d’arrels i tiges a través de la millora de l’absorció, assimilació i ús d’aigua i de nutrients. També actuen a través d’activitats enzimàtics i de canvis fisiològics, bioquímics i hormonals.
Els bioestimulants es poden classificar en:
– bioestimulants microbians: poden ésser bacteris, fongs micorrizals, altres fongs.
– bioestimulants no-microbians: són extractes naturals que contenen, entre d’altres, substàncies húmiques, materials orgànics complexos, elements químics, sals inorgàniques, extractes d’algues, derivats de la quitina i del quitosan, antiperspirants, aminoàcids lliures o altres substàncies nitrogenades.
El laboratori de Mulet ha desenvolupat Calbio (BS) com a bioestimulant no-microbià. En aquest treball el combinen amb el bioestimulant microbià soca BM08 (Bacillus megaterium).
Disseny experimental
Els experiments es realitzaren en hivernacles que reproduïen el cultiu mediterrani tradicional de l’enciam. L’assaig es realitzà entre el 20 de setembre del 2022 i el 9 de novembre del mateix any, en un hivernacle de malla del Centro de Experiencias Cajamar, a Paiporta.
Les llavors d’enciam (Lactuca sativa L. cv. Romana) eren esterilitzades amb una solució amb lleixiu durant 15 minuts, per després esbandir-les amb aigua destil·lada. La germinació es dugué a terme en llits de llavors amb fibra de coco en CUCALA AGRICOLA S.L., entre el 25 d’agost i el 20 de setembre del 2022. Plançons d’un mes eren trasplantats en pots de 5 L i col·locats en un hivernacle amb una separació de 15 cm entre pots.
L’estrès salí s’aplicava durant les quatre setmanes posteriors al trasplantament. La sal s’afegia en etapes progressives, a 40 mmol/L de NaCl diaris, fins a 100 mmol/L NaCl, que s’administraven durant 22 dies.
En experiments pilot, Benito et al. comprovaren l’efecte sobre el rendiment de l’enciam de diferents combinacions de BS amb micorrizes o bacteris. El millor efecte l’aconseguien amb la soca BM08, de Bacillus megaterium. BM08 no té la capacitat de colonitzar teixits vegetals interns, però sí de colonitzar la rizosfera i el rizopla, de manera que pot interactuar amb les arrels.
El disseny experimental consistia en un total de vuit tractament amb 20 rèpliques cadascun, de manera que hi participaren 160 plantes: 1) CT; 2) BS; 3) BM08; 4) BS-BM08; 5) CT-estrès salí; 6) BS-estrès salí; 7) BM08-estrès salí; 8) BS-BM08-estrès salí.
BS o Calbio és una barreja de quatre extractes naturals diferents. El comercialitza Caldic Iberica SLU, amb seu a Barcelona.
BM08 es troba en la Col·lecció Espanyola de Cultius Tipus sota l’entrada CERC 9703.
La conductivitat elèctrica dels substrats es mesurava setmanalment, prenent-hi una mostra de 3 grams de sòl, i resuspenent-la en 100 mL d’aigua destil·lada.
Altres tècniques aplicades foren:
– el seguiment de la colonització microbiana de la rizosfera de l’enciam. Això es feia amb cultius de la rizosfera en plaques TSA.
– el 9 de novembre del 2022 es va fer la collita dels enciams experimentals. De cada cap es mesurava la mida, perímetre i pes fresc. Després de deixar-les a l’estufa a 65 °C durant 7 dies mesuraven el pes sec. Prèviament s’havia valorar el percentatge de fulles amb puntes cremades.
– en mostres de fulles de joves (discs) es feia una estimació de turgència en deixar-los a estufa a 60°C durant 48 hores.
– la conductivitat elèctrica foliar es mesurava en discs d’1 cm.
– en mostres de 100 grams de fulles fresques es feia una determinació de pigments fotosintètics: clorofil·la a, clorofil·la b i carotenoides. Amb un fluorímetre es calculava el rendiment del fotosistema II.
– determinació de prolina i de sucres totals: això es mesurava en 100 grams de fulla fresca.
– fenols totals i flavonoides: això es mesurava en la fase metanòlica d’extracte de fulla pel mètode colorimètric de Folin-Ciocalteau.
– es feien assaigs enzimàtics en mostres d’arrels i de fulles. Així es mesurava la SOD (EC 1.15.1.1), la catalasa (EC 1.16.1.6), l’APX (EC 1.11.1.11) i la GR (EC 1.6.4.2).
– la peroxidació lipídica es determinava per la reacció amb l’àcid tiobarbitúric.
– el contingut hormonal s’avaluava en teixit liofilitzat.
– l’anàlisi de metabòlits primaris es feia en teixit liofilitzat en la Plataforma Metabolòmica de l’Institut de Biologia Molecular i Cel·lular de Plantes, de UPV-CSIC, per GC-MS.
– l’extracció d’ARN total es feia en fulles i arrels. La RNA-seq es realitzà en la plataforma DNBseq.
– la PCR quantitativa validava les dades de RNA-seq per alguns gens.
En plantes tractades amb BM08 o amb BS+BM08, hi ha detecció de BM08 tant en condicions normals com d’estrès salí. Aquesta detecció fou confirmada amb anàlisi de seqüència del gen ribosomal 16 S. Ara bé, la salinitat comporta una reducció d’aquesta càrrega microbiana. La reducció és més clara en el tractament BS+BM08 que en el tractament BM08. En condicions normals, però el tractament BS+BM08 condueix a una càrrega microbiana superior a la que s’assoleix en el tractament BM08.
L’efecte de BS+BM08 en el rendiment de l’enciam
El rendiment del cultiu d’enciam era mesurat pel pes dels caps en el moment de la collita. També es mesurava la longitud i diàmetre dels caps.
Els tractaments BM08 i BS+BM08 augmentaven de manera semblant (en un 16%) el pes dels caps d’enciam en cultius d’irrigació normal. En condicions d’estrès salí era el tractament BS+BM08 el que augmentava el pes dels caps en un 30%, en gran part mediat per un augment del diàmetre.
Determinacions bioquímiques i fisiològiques
El factor d’alleujament d’estrès (SAF) indica que els millors resultats els ofereix el tractament BS+BM08.
Sota condicions normals, el tractament BS+BM08 condueix a una major percentatge de matèria seca.
Sota condicions d’estrès salí, els tractaments BM08 i BS+BM08 condueixen a un augment semblant del percentatge de matèria seca.
Els tractaments BM08 i BS+BM08 prevenen en condicions d’estrès salí en part l’aparició de puntes cremades als marges de les fulles. Encara més efectiu en aquesta prevenció és el tractament BS.
L’anàlisi de components principals de paràmetres fisiològics i bioquímics d’arrels i fulles mostra la diferenciació de les plantes tractades amb BS+BM08.
Contingut de fitohormones
El perfil de fitohormones, analitzat per components principals, indica l’impacte de l’estrès salí. Els tractaments BM08 i BS+BM08 també hi tenen un impacte, particularment a través de la isopenteniladenosina (IPR).
Perfil metabolòmic
L’anàlisi metabolòmica abastava 47 metabòlits primaris en fulles i 30 metabòlits primaris en arrels. En fulles els metabòlits amb més concentració són la fructosa i la glucosa, seguits del mio-inositol, l’àcid critramàlic, l’àcid aconític i l’àcid glicínic. En arrels els metabòlits de major concentració són la rafinosa i la sacarosa, seguits de la fructosa i de l’àcid màlic.
L’estrès salí té un impacte metabolòmic. Sobre aquest impacte els tractaments de bioestimulació indueixen tota una sèrie de diferències.
Perfils d’expressió global
La seqüenciació d’ARN (RNA-seq) permet Benito et al. d’analitzar els canvis transcripcionals. Les dades de RNA-seq cobreixen 28.669 gens. Paral·lelament s’aplicà una tècnica de RT-qPCR per diversos gens rellevants.
El tractament BS+BM08 produeix en condicions normals 4.763 gens d’expressió diferencial en arrels. Aquesta xifra puja a 6.703 en estrès salí. La majoria de diferències consisteixen en una sobreexpressió.
El tractament BS+BM08 produeix en condicions normals 617 gens d’expressió diferencial en fulles. Aquesta xifra puja a 1.799 en estrès salí. La majoria de diferències consisteixen en una repressió.
El 90% dels gens d’expressió diferencial es troben anotats funcionalment. Els gens d’expressió diferencial sota el tractament BS tenen a veure amb vies metabòliques, tant en fulles com en arrels, tant en condicions d’irrigació normal com d’estrès salí.
El tractament BS+BM08 enriqueix gens implicats en vies de senyalització de transducció de senyals d’hormones i de ritme circadià. Sota estrès salí, hi ha una activació de vies vinculades a l’espliceosoma, al metabolisme de pirimidina, de la biosíntesi de ribosomes, al processament de proteïnes en el reticle endoplasmàtic i els factors de transcripció basals.
En condicions d’estrès salí, els tractaments BM08 i BS+BM08 promouen l’expressió del gen responsable de l’enzim citocinin-deshidrogenasa (EC:1.5.99.12). També hi ha sobreexpressió gels gens de la cis-zeatina O-glucosiltransferasa (2.4.1.215) i de la citocinina-N-glucosiltransferasa (2.4.1.-).
Les plantes tractades amb bioestimulants perceben menys estrès salí
Els bioestimulants fan que les plantes pateixen menys estrès en condicions experimentals de salinització del sòl. Això fa que presentin menys símptomes però també que no activin amb tanta força les defenses antioxidants. Benito et al. pensen que en aquesta protecció actuaria l’hormona IPR, que pertany a la família de les CK. Aquesta hormona participaria en la protecció de la clorofil·la.
BS i BM08 tindrien un efecte combinat de potenciació. Això es manifesta en un major nombre de gens d’expressió diferencial en el tractament BS+BM08.
Benito et al. es comprometen a continuar l’estudi en enciams mutants que són deficients en la biosíntesi de CK. Això ajudaria a entendre el rol de CK i de SnRKs en la protecció de les plantes tractades amb BS+BM08 en condicions d’estrès salí. Una altra línia d’investigació és estudiar si en altres cultius hortícoles observen el mateix que han detectat en l’enciam.
Lligams:
– The combination of a microbial and a non-microbial biostimulant increases yield in lettuce (Lactuca sativa) under salt stress conditions by up-regulating cytokinin biosynthesis. Patricia Benito, Marina Celdrán, Javier Bellón, Vicente Arbona, Miguel González-Guzmán, Rosa Porcel, Lynne Yenush, José M. Mulet. Journal of Integrative Plant Biology (2024).
– Pàgina web de l’IBMCP (Institut de Biologia Molecular i Cel·lular de Plantes).
Des de la Mediterrània 