L’esferulització d’alcaloids guanidínics policíclics en l’esponja incrustant “Crambe crambe” (Metabolòmica mediterrània, 27/2016)

De la mateixa manera que la genòmica és la ciència dels sistemes genètics, o la proteòmica la dels sistemes proteics, la metabolòmica la podem definir, com fa Bennett Daviss, com “l’estudi sistemàtic de les petjades químiques úniques que deixen enrere processos cel•lulars específics”. No es tracta tant de l’estudi individual de tal o tal metabòlit, com l’estudi sistemàtic de “tots” els metabòlits presents en una mostra. És clar que també podem aprofitar les tècniques metabolòmiques per rastrejar un tipus concret de metabòlit. Això és el que han fet un grup d’investigadors coordinat per Eva Ternon i Olivier P. Thomas, de l’Institut de Química de Niça, per estudiar el procés fisiològic que fa servir l’esponja Crambe crambe per exudar alcaloids guanidínics policíclics bioactius. Aquestes substàncies són tòxiques per alguns competidors de substrat d’aquesta esponja. C. crambe és una esponja endèmica de la Mediterrània, per bé que també hi ha alguna població en l’Atlàntic. El metabolisme especialitzat d’aquesta esponja, i particular els seus alcaloids guanidínics policíclics, han rebut considerable interès per les seves propietats farmacològiques.

Colònia de Crambe crambe, fotografiada a Elba

La metabolòmica marina ambiental

Olivier P. Thomas és professor a la Universitat de Niça Sophia Antipolis, a la qual és adscrit l’Institut de Química. Actualment, però, Thomas es troba en situació de semi-delegació a l’Institut Mediterrani de Biodiversitat i d’Ecologia marina i continental (IMBE), a Marselha, alhora que també té és professor de la Universitat Nacional d’Irlanda de Galway. Les que sí són a l’Institut de Química de Niça actualment són Eva Ternon i Lina Zarate, encara que Zarate ja té un peu al Laboratori de Biologia del Desenvolupament de Vilafranca de Mar, on també hi ha René Dumollard. En la col•laboració que ens ocupa també participaren Marcelino T. Suzuki i Julie Croué, del Laboratori de Biodiversitat i Biotecnologies Microbianes (LBBM) de Banyuls de la Marenda (Rosselló). Suzuki és, de fet, el director d’aquest centre, adreçat, entre d’altres objectius, a la promoció de la innovació científica en la interfície sanitat-ambient.

Els experiments, com hem dit, tenien l’objectiu d’identificar millor el procés pel qual Crambe crambe allibera alcaloids guanidínics policíclics (PGA, en l’acrònim anglès) a l’entorn. En el disseny d’experiments participaren Ternon, Thomas i Suzuki. En la realització dels experiments, a més de Ternon, participaren Dumollard, Zarate, Croué, i Sandrine Chenesseau (de l’IMBE).

Crambe crambe

La descripció d’aquesta espècie d’esponja la devem a Eduard Oscar Schmidt (1823-1886), que treballà amb espècimens de la Mar Adriàtica, i que també realitzà importants contribucions en la fisiologia d’aquests organismes. Es presenta en forma de colònies planes, de les quals emergeixen els òsculs de cada individu. S’incrusten a la roca, i cada colònia pot arribar a cobrir fins 1 metre quadrat de superfície. També poden créixer damunt de la conca de bivalves sedentaris. S’alimenten per filtració de microorganismes unicel•lulars.

És una espècie de distribució atlanto-mediterrània. Requereix substrats durs, i viu a fondàries de 5-30 metres, a condició que siguin prou il•luminades.

Els exudats de C. crambe han estat estudiats intensament pel que fa als seus metabòlits especialitzats. Destaca l’ample ventall d’alcaloids guanidínics policíclics (PGA). Els PGAs exudats es classifiquen en dues famílies químiques:
– cambrescines. Amb un o dos anells heterocíclis.
– cambrescidines. Amb cinc anells heterocíclics. La cambrescidina 800 té activitat antifúngica i antiviral. La cambrescidina 816 s’ha demostrat antitumoral en cultius cel•lulars.

Les cambrescines i cambrescidines deuen tindre en els teixits de les esponja una acció antimicrobiana, i en la superfície una acció antiadherent. Però és menys conegut si tenen un paper ecològic quan són emesos a l’exterior. Ternon et al. volien saber, en primer lloc, si aquestes substàncies són exudades en prou quantitat i, en cas afirmatiu, com es difonen i com afecten a potencials competidors de substrat.

Experiments in situ i en el laboratori

El port de Vilafranca de Mar (Provença)

Actualment situada sota el nivell de mar, la Grota dau Lido fou habitada per l’home primitiu, com també ho fou la Grota de Coralh. Són les dues grutes de la Rada de Vilafranca. És en la primera d’aquestes grutes on es feren, a una fondària de 19 metres, la recollida de mostres i els experiments “in situ”.

Per als experiments “in situ” se seleccionaren dotze espècimens, cadascun de 3-5 òsculs i d’una superfície de 50 cm2. De cadascun d’aquests espècimens es prengueren mostres d’1 L d’aigua a 1 cm de la superfície. En sis casos, s’estressà l’animal tocant-lo amb les puntes dels dits, i se’n prengueren noves mostres d’aigua.

Amb un martell i un cisell, hom arrencà la roca on eren incrustades cadascuna de les dotze colònies estudiades. Les mostres d’esponja foren després eixugades i congelades a -20ºC. Pel que fa a les mostres d’aigua, se’n feren filtracions seqüencials i s’aliquotaren per a les diferents tècniques (microbiològiques, cel•lulars, metabolòmiques).

L’estudi metabolòmic es va fer en cromatografia líquida de molta capacitat (UHPLC) acoblada a un espectròmetre de masses d’alta resolució (HRMS). De les mostres d’aigua s’analitzà tant la fase particulada (separada amb filtres de niló de 0,45 o de 3 micres) com la fase filtrada, prèvia extracció orgànica. La identificació dels senyals obtinguts per UHPLC-HRMS la restringiren a les crambescines i crambescidines, bo i aprofitant que són compostos força ben estudiats.

Un alliberament constant i especialitzat d’alcaloids guanidínics policíclics

Les mostres analitzades, tan la fracció dissolta com la particulada, mostren nivells mesurables de PGAs. Els valors van de 0,03% a 0,37% respecte de les concentracions d’aquests metabòlits en els teixits de l’esponja. Les dades assenyalen un alliberament constant. El compost més abundant és la crambescidina-816, seguida per la cambrescina A2-448 i la cambrescina C1-466.

L’estrès mecànic assajat sobre les esponges resultava en augment notable (x50) d’aquests metabòlits en l’aigua. De fet, després de l’estrès, hi havia una caiguda dels nivells endometabòlics de PGAs degut a aquest alliberament. Les PGAs alliberades en resposta a l’estrès mecànic s’associen a la fracció particulada i, especialment, a les cèl•lules esferuloses. Aquestes cèl•lules, de 10 micres de diàmetre, apareixen com un sac de petites vesícules (1-3 micres), les denominades esfèrules. En els filtres observats en el microscopi, s’observen bé les cèl•lules esferuloses intactes o les esfèrules ja alliberades. Cal pensar, doncs, que és a través de les esfèrules que es produeix l’alliberament multiplicat de PGAs en resposta a l’estrès mecànic. De fet, Ternon et al. estimen que en una esfèrula d’un volum de 4,2 mm3 hi pot haver 136.000 molècules de cambrescidina-816.

Un assaig ecotoxicològic

Estimades aquestes concentracions basals i estimulades de PGAs, Ternon et al. dissenyaren un assaig ecotoxicològic. Utilitzaren la crambescina A2-462 (CA) i la cambrescidina 816 (C816), presents en la quimioteca de l’Institut.

“Phallusia mammillata”. És una espècie de tunicat ascidi solitari de distribució atlanto-mediterrània

Testaren aquestes substàncies damunt embrions del tunicat hermafrodita Phallusia mamillata. Aquesta espècie la mantenen en laboratori. Així estimularen l’alliberament d’òvuls i esperma d’individus, i deixaren que es produís la fertilització. En total, obtingueren entre 50 i 100 zigots que deixaren en desenvolupar en presència o absència de CA o C816. A les 12 hores, observaren com s’havien desenvolupat les larves:
– amb un bon desenvolupament, atenent sobretot a l’extensió de la cua.
– amb un mal desenvolupament, marcat per malformitats o absència de cua, o manca de gastrulació, o absència de diferenciació tissular.
– havien mort.

Val a dir, que per solubilitzar CA o C816 empraren dimetilsulfòxid (DMSO), de manera que fins i els controls havien de dur aquesta substància a una concentració de 0,1%. El DMSO resulta embriotòxic a un 1%. En tot cas, C816 ja és teratogènic a 1 μM, mentre CA ho és a partir de 50 μM. En concentracions inferiors, C816 és embriotòxic, i cal dir aquestes concentracions ja són assolides de manera natural en esponges C. crambe no-pertorbades.

L’esferulització

L’esferulització, és a dir l’alliberament de cèl•lules esferuloses i, al seu torn, d’esfèrules carregades d’aquestes substàncies citotòxiques, semblen jugar un paper en l’ecologia de C. crambe. Aquest procés suposa la creació d’una mena d’escut químic.

Queden naturalment, moltes qüestions obertes sobre aquests metabòlits. L’estudi de Ternon et al., però, sembla indicar que aquestes substàncies són produïdes per cèl•lules d’esponja i no per bacteris simbionts.

Pel que fa a l’impacte ecològic d’aquest estudi, hom remarca que C. crambe és una espècie molt comuna a la Mediterrània i, darrerament, sembla implantar-se amb més força als arxipèlags macaronèsics (Madeira, Açores, Canàries, etc.). El trànsit naval ajuda al trencament d’antigues barreres oceanogràfiques. Alhora, l’acidificació dels oceans, que és detrimental per als coralls, fa que ecosistemes coral•lins cedeixin pas a ecosistemes dominats per esponges i macroalgues. Ternon et al. pensen que un exo-metaboloma altament bioactiu pot ajudar encara més a aquests processos de difusió.

Lligams:

Spherulization as a process for the exudation of chemical cues by the encrusting sponge C. crambe. Eva Ternon, Lina Zarate, Sandrine Chenesseau, Julie Croué, Rémi Dumollard, Marcelino T. Suzuki, Olivier P. Thomas. Scientific Reports 6: 29474. doi: 10.1038/srep29474.

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: