La perfecció evolutiva de la triosafosfat-isomerasa (Enzimologia mediterrània, 1/2017)

La teoria evolutiva fonamentada en la selecció natural ens ajuda a entendre l’encaix entre estructura i funció en els sistemes biològics. La contradicció entre la capacitat reproductiva potencials dels organismes i la migradesa dels recursos força una lluita per l’existència en la qual els més aptes acaben per escampar les seves característiques hereditàries. És clar que aquesta aptitud és sempre una aptitud relativa, vinculada a l’ambient. La gran diversitat d’ambients, doncs, condueix també una gran diversitat de formes de vida, a una multitud d’estratègies metabòliques. Tanmateix, la bioquímica fonamental dels organismes té punts en comú. Els més diversos organismes, per exemple, comparteixen els metabòlits i les reaccions químiques (rutes metabòliques) que en permeten la interconversió. Una ruta metabòlica central és la glicòlisi, que a través de 10 reaccions metabòliques transforma una molècula de glucosa en dues molècules de piruvat. Es tracta d’una ruta catabòlica, en el sentit que té un balanç energètic positiu. De les 10 reaccions metabòliques, té un important rol regulador la cinquena reacció, consistent en la interconversió de dos isòmers de triosa-fosfat, la dihidroxiacetona-fosfat (DHAP) i la D-gliceraldehid-3-fosfat (GADP). Aquesta reacció metabòlica és catalitzada per la triosafosfat-isomerasa (TIM; EC 5.3.1.1.). L’enzim TIM el trobem en tots els organismes coneguts. Només en són excepció alguns bacteris, extraordinàriament auxotròfics, que no realitzen glicòlisi, com és el cas dels ureaplasmes. La importància metabòlica central d’aquest enzim suposa doncs una forta pressió selectiva. La seqüència proteica és altament conservada, especialment en les regions més implicades en la funció catalítica. En multitud d’estudis genètics, el gen TIM o el gen GAPDH (que catalitza la reacció següent de la glicòlisi) són utilitzats com a referència normalitzadora (“housekeeping gene”), així com també ho són l’ARNm, la proteïna o la pròpia activitat enzimàtica. En els manuals d’enzimologia, el TIM és considerat un exemple d’enzim perfectament evolucionat, que hauria assolit la taxa de reacció més alta possible. Davor Juretić, juntament amb Željana Bonačić Lošić, Tomislav Donđivić, han intentat optimitzar l’activitat catalítica de TIM a través de la maximització de producció d’entropia. En un article al Journal of Biological Physics semblen haver reeixit.

L’aplicació de l’entropia màxima en la cinètica enzimàtica

Davor Juretić

Amb una trajectòria de recerca de més de 45 anys, el físic Davor Juretić (*1944) treballa encara actualment a l’Institut Mediterrani de Ciències Biològiques (MedILS), de Split. És professor emèrit de física de la Facultat de Ciències de la Universitat de Split. Ja des de l’època que es doctorà, al Departament de Biofísica, de la Universitat de l’Estat de Pennsilvània, s’interessà en l’estudi del mecanisme d’acció de pèptids antimicrobians des de la perspectiva de bioenergètica. També ha treballat en la predicció de l’estructura secundària de proteïnes de membrana relacionades amb el metabolisme energètic. En les darreres dues dècades ha estudiat l’aplicació dels principis de producció d’entropia màxima en la cinètica d’enzims implicats en el metabolisme energètic. L’anomenada hipòtesi d’acoblament evolutiu considera els organismes vius des de la seva capacitat superior per accelerar l’evolució termodinàmica de l’entorn a través de l’augment de la pròpia entropia d’informació.

En aquesta recerca sobre l’optimització de l’enzim triosafosfat-isomerasa (TIM) ha col·laborat amb dos dels seus deixebles, Željana Bonačić Lošić i Tomislav Donđivić.

Željana Bonačić Lošić va nàixer a Split el 3 de juliol del 1973. Juretić fou en el 1997 un dels seus dos directors de la tesina de grau que versava sobre les propietats dielèctriques de cristalls. Va fer els estudis de post-grau a la Universitat de Zagreb, sota la direcció d’Aleksa Bjelis, doctorant-se en el 2006. Des del 1998 fa docència i recerca a la Facultat de Ciències de la Universitat de Split.

Tomislav Donđivić és actualment professor de física a l’Escola de Medicina de Šibenik. En el 2010 fou fundador del portal de divulgació i notícies científiques Čuda Prirode.

La triosafosfat-isomerasa

Estructura molècula de la triosafosfat-isomerasa. L’enzim és un homodímer, cadascuna de les subunitats dels quals consta d’uns 250 aminoàcids

L’enzim triosafosfat-isomerasa consisteix en homodímer. Cada subunitat consta d’una cadena peptídica de 250 residus aminoacídics. En aquests 250 residus se succeeixen un total de vuit alfa-hèlix i vuit beta-làmines. De fet, aquesta estructura rep el nom de “barril TIM” i constitueix un dels plegaments proteics més comuns: les alfa-hèlixs queden en la part exterior de la proteïna i les beta-làmines, amb aminoàcids més hidròfobs, hi romanen a l’anterior. És en el centre del barril TIM on trobem el lloc catalític, en el qual participen un residu d’àcid glutàmic i un altre d’histidina.

L’àcid glutàmic (E, residu 165) i la histidina (H, residu 95) del centre actiu del TIM es conserven en totes les versions de l’enzim descrites en la literatura. És a través de l’E165 que s’uneix el substrat, bé sigui DHAP o GAP, que queda desprotonat. El residu H95 hi dóna un protó, formant-se un intermediari enediol. La reacció es completa amb un nou cicle de desprotonació/protonació.

La reacció catalitzada per TIM afavoreix el pas GADP → DHAP en una relació 20:1 sobre el pas DHAP → GADP. En condicions fisiològiques, però, el GADP produït és ràpidament metabolitzat per l’enzim GAPDH, de manera que TIM transforma de manera neta DHAP a GADP. Gràcies a aquest pas, hom aconsegueix que les dues trioses diferents que resulten del trencament de la fructosa-difosfat convergeixin a GADP i continuï la glicòlisi.

Una altra regió conservada de la cadena proteica és la formada pels residus 166-176, que constitueixen un llaç que contribueix a l’estabilització del centre actiu durant la catàlisi connectant-hi a través d’un pont d’hidrogen amb el grup fosfat del substrat.

Existeixen altres aminoàcids rellevants per a la funció, si bé no tan imprescindibles, com és el cas de la lisina-12. Ara bé, la substitució de la lisina-12 per altres aminoàcids carregats comporta una pèrdua de funció.

Comptat i debatut, l’enzim TIM és considerat un exemple típic d’enzim constitutiu plenament evolucionat per tal de fornir la taxa de reacció més alta possible. Bonačić Lošić et al. proven d’examinar aquesta assumpció a través del principi de maximització d’entropia dins dels límits coneguts d’aquesta activitat enzimàtica.

La variable a analitzar és el flux cíclic d’estadi estacionari, corresponent a la producció d’entropia. L’enzim TIM, en aquesta modelització, és considerat en quatre estats funcionals, corresponents als quatre passos intermedis que van de E165+DHAP a E165+GADP.

D’acord amb el requeriment de la producció d’entropia màxima (MaxEP), per a les tres primeres transicions hi ha una davallada de la producció d’entropia total. Cal suposar, doncs, d’acord amb el principi d’entropia màxima, que la TIM és realment un enzim perfecte per a aquestes transicions.

No passa el mateix, però, amb la darrera de les transició, la que condueix a l’alliberament del substrat GADP. En aquest cas el requeriment de MaxEP condueix a un augment del 30% de l’activitat enzimàtica, alhora que a un augment de la constant d’especificitat (kcat/KM).

La cinètica de l’enzim TIM és una de les més intensament estudiades. Hewitson et al. (2014) feren un estudi comparatiu de la seqüència proteica i de la cinètica d’aquest enzim en diferents espècies de nematodes, en ratolins, en humans i en conills. És remarcable la similitud en els paràmetres cinètics bàsics, la velocitat màxima (Vmax) i la constant d’afinitat (KM).

Així doncs, segons Bonačić Lošić et al., el pas d’alliberament del producte final és el pas limitant de la catàlisi. Altres estudis fonamentats en la termodinàmica irreversible no havien detectat aquesta deficiència. És clar que, com hem dit, en el context cel·lular, aquesta limitació no té cap efecte, ja que l’acció de l’enzim GAPDH acaba per compensar-la. La selecció natural no pot operar allà on no hi ha possibilitat d’avantatge selectiu.

A través d’estudis estructurals, amb substitucions aminoacídiques, Bonačić Lošić et al. consideren que seria possible augmentar la freqüència d’obertura del llaç i elevar així la taxa d’alliberament del producte final (el GAPD), optimitzant finalment la taxa de reacció.

Lligams:

Is the catalytic activity of triosephosphate isomerase fully optimized? An investigation based on maximization of entropy production. Željana Bonačić Lošić, Tomislav Donđivić, Davor Juretić. Journal of Biological Physics 10.1007/s10867-016-9434-3 (2017).

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: