En el 1923, el citòleg nord-americà Theophilus Painter deixà establert el nombre de cromosomes en les cèl·lules humanes en 24 parells, basant-se en el comptatge de 24 cromosomes diferents en espermatòcits de talls histològics de testicles. Hom considerà després remarcable que aquest mateix nombre cromosòmic es donés en les altres espècies de simis antropoides, goril·les i ximpanzés. Però en el 1956, Albert Levan i Joe Hin Tijo, al Laboratori de Càncer i Cromosomes de l’Institut de Genètica de Lund (Suècia), van examinar cèl·lules normals i tumorals humanes i arribaren a la conclusió que el nombre cromosòmic real de l’espècie humana era de 23 parells de cromosomes. Tijo, entre 1948 i 1959, feia estades estivals en el laboratori de Levan, però la resta de l’any era investigador de la Estación Experimental de Aula Dei, a Saragossa, i així ho va fer constar en l’article titulat “The Chromosome Number of Man”. Des de llavors, hom ha posat força interès en la disploïdia existent entre les espècies actuals d’homínids: mentre orangutans, goril·les i ximpanzès tenen una dotació cromosòmica haploide de 24 cromosomes, en humans aquesta dotació es redueix a 23. Amb motiu del 60è aniversari de la publicació de l’article de Tijo i Levan, Manuel Ruiz Rejón repassava algunes implicacions en un text titulat precisament: “The Origin of the Human Species: a Chromosome Fusion”. Efectivament, en algun moment encara no determinat de la història del llinatge humà es produí una fusió cromosòmica que resultà en el cromosoma 2 humà. I què feia Tijo a Aula Dei? De fet, bàsicament hi feia recerca cromosòmica en plantes. Fa unes setmanes, ens fèiem ressò d’una recerca sobre l’evolució del gènere Anthoxanthum, amb una complexa història de poliploïdies: si el nombre bàsic de cromosomes en aquest gènere és de 5 parells (10 = 2x), n’hi ha espècies que mostren dotacions cromosòmiques de 4x, 12x, 16x i 18x. Aquesta poliploïdia és el resultat de creuaments en els quals no es va fer la reducció meiòtica habitual. En la disploïdia la diversitat en el nombre cromosòmic no segueix aquests múltiples. Per exemple, en un gènere d’asteràcies, Reichardia, integrat per 8-10 espècies de distribució mediterrània (algunes d’elles conegudes com a cosconilla o panconia), trobem 7, 8 o 9 parells de cromosomes segons els casos. Un grup d’investigadors, coordinat per Sonja Siljak-Yakovlev, del CNRS, i Joan Vallès, del Laboratori de Botànica de la Universitat de Barcelona, ha estudiat la disploïdia del gènere Reichardia relacionant-la amb característiques estructurals del genoma, com la distribució d’heterocromatina i dels gens ribosòmics (ADNr). La seva recerca s’ha publicat a la revista PLoS One.
“Reichardia gaditana”, fotografiada per Xemenadura el febrer del 2010 al Pinar de La Barrosa, a Chiclana. La dotació cromosòmica diploide d’aquesta espècie és de 8 cromosomes (2n = 16)
La disploïdia del gènere Reichardia
Aquesta recerca fou concebuda per Sonja Siljak-Yakovlev (*1948), professora emèrita de biologia a la Université Paris-Sud i investigadora de la unitat d’Ecologie Systématique Evolution del CNRS. La recerca es finançà a través del CNRS però també, a través de Joan Vallès i Xirau i de Teresa Garnatje, de la Generalitat de Catalunya (projecte 2014SGR514) i del Govern d’Espanya (n. CGL2013-49097-C2-2-P). Vallès és catedràtic de botànica de la Facultat de Farmàcia de la Universitat de Barcelona. Botànic i filòleg, és conegut especialment per les seves aportacions a la fitonímia i a l’etnobotànica. És investigador al Laboratori de Botànica, unitat associada al CSIC, i adscrita a la Facultat de Farmàcia. Teresa Garnatje és directora de l’Institut Botànic de Barcelona (IBB-CSIC-ICUB) i investigadora del grup de recerca en Biodiversitat i evolució de plantes.
Siljak-Yakovlev es graduà en biologia a la Universitat de Sarajevo i manté contactes amb grups de recerca com el de Vlatka Zoldoš, del Departament de Biologia de la Universitat de Zagreb. La experiència de Zoldoš en metodologies de citogenètica molecular ha estat central en aquest projecte de recerca. També en la metodologia, juntament amb Siljak-Yakovlev i Zoldoš, ha participat Oriane Hidalgo, del grup de Comparative Plant & Fungal Biology dels Royal Botanic Gardens de Kew (Richmond, Surrey).
En l’obtenció de dades participaren, a més de Siljak-Yakovlev, Vallès i Hidalgo, Teresa Garnatje. En l’anàlisi formal participaren Zoldoš, Vallès, Garnatje i Hidalgo. Hidalgo i Garnatje forniren les eines de programari. En la visualització, a més de Siljak-Yakovlev, Vallès, Garnatje i Hidalgo, participà Bernard Godelle, de l’Institut des Sciences de l’Evolution, de la Universitat de Montpelhièr II.
En la redacció de l’article participaren Siljak-Yakovlev, Godelle, Vallès i Garnatje. Aquest redactat fou tramès a la revista PLoS One el passat 5 d’abril. Se’n seguí una revisió, en la que participaren Siljak-Yakovlev, Vallès, Garnatje i Hidalgo, i l’article fou admès el 16 de juliol.
La tria del gènere Reichardia com a model la fonamentaren en el fet que és un gènere amb un nombre reduït d’espècies (entre 8 o 10, segons les classificacions), que mostra una disploïdia, amb nombres cromosòmics bàsics de 9, 8 o 7:
– Reichardia macrophylla, dels Alps Dinàrics, mostra un nombre cromosòmic de 9.
– Reichardia glauca, distribuïda a l’Àsia sud-occidental, també mostra un nombre cromosòmic de 9.
– Reichardia albanica, distribuïda a Albània és propera a les dues espècies i manté el mateix nombre cromosòmic.
– Reichardia picroides és de distribució circummediterrània i té un nombre cromosòmic de 7.
– Reichardia intermèdia és de distribució circummediterrània i té un nombre cromosòmic de 7.
– Reichardia tingitana, distribuïda en un àmplia llenca d’Afràsia, des de les Açores fins a la Índia, té un nombre cromosòmic de 8.
– Reichardia gaditana, distribuïda a la Península Ibèrica.
– Reichardia crystallina, distribuïda a les Illes Canàries, té un nombre cromosòmic de 8.
– Reichardia famarae, distribuïda a les Illes Canàries, té un nombre cromosòmic de 8.
– Reichardia ligulata, distribuïda a les Illes Canàries, té un nombre cromosòmic de 8.
Aquesta llista de 10 espècies es redueix a 8, pels autors que consideren que R. macrophylla i R. albanica són subespècies de R. picroides. Però el nombre cromosòmic desaconsella aquesta consideració. Els botànics pensen que R. macrophylla, R. albanica i R. dichotoma descendeixen de poblacions terciàries de R. picroides que en l’època de les glaciacions quaternàries trobaren refugi en zones dolomítiques de les serralades de la Mediterrània Oriental.
L’interès de Siljak-Yakovlev per a aquest gènere, de fet, arrenca de l’estudi de R. macrophyla com a espècie endèmica o relíquia de la flora iugoslava. Ja en els anys 1980, n’estudià el cariotip així com els patrons d’heterocromatina a través de la tècnica de tinció de Giemsa-C. Ja llavors remarcaren que mentre R. gaditana i R. tingitana presentaven una heterocromatina abundant, en R. dichotoma i R. macrophyla aquesta era ben reduïda o indetectable. A mig camí d’aquestes dues agrupacions, hi havia R. picroides.
Tres tècniques de citogenètica molecular
Siljak-Yakovlev et al. van més enllà de les tècniques de cariotip i tinció Giemsa-C:
– citometria de flux per valorar la quantitat d’ADN i el %GC. El %GC s’estima amb la utilització del fluorocrom mitramicina, mentre que el %AT s’estima amb la bisbenzimida de Hoechst 33342. Per a aquesta prova feien servir mostres de fulles.
– bandeig amb fluorocroms per identificar la distribució cromosòmica d’ADN ric en GC i en heterocromatina neutra. La preparació de cromosomes es feia a partir de puntes d’arrel, de les quals se n’obtenien protoplasts.. La tinció per revelar les regions riques en GC es feia amb cromomicina A2 (CMA). Això revela regions riques en GC o riques en AT que poden ser heterocromatina. Però l’heterocromatina pot ser neutra, amb una %GC intermedi: per detectar l’heterocromatina neutra feren ús del fluorocrom DAPI.
– hibridació in situ per identificar la posició cromosòmica dels gens de l’ARN ribosòmic, el 35S i el 5S. Per a cada preparació, feien servir un mínim de 10 protoplasts en metafases que disposessin els cromosomes de manera nítida.
Aquestes tècniques són combinades amb les clàssiques de mesura de mida genòmica i del nombre cromosòmic. Alhora, feren una valoració de la mida del gra de pol·len, una variable sovint influïda per la citogenètica. Aquesta valoració la feren en preparacions de pol·len acetolisat, i estimaren els diàmetres polar i equatorià d’uns 100 grans en cada preparació.
Les mostres analitzades procedeixen dels herbaris del Centre de Documentació de Biodiversitat Vegetal, de l’Institut Botànic de Barcelona, del BEOU de la Universitat de Belgrad i de la Col·lecció Personal de Siljak-Yakovlev.
Per fer una anàlisi filogenètica de les espècies estudiades, feren una extracció d’ADN, i posterior amplificació i seqüenciació, realitzades en els Centres Científics i Tecnològics de la Universitat de Barcelona. Les seqüències obtingudes foren dipositades en el GenBank i després analitzades per tal de reconstruir les relacions ancestrals.
Un retrat genòmic del gènere Reichardia
El genoma holoploide (2C) de les poblacions estudiades oscil·la dels 2,86 pg de R. picroides (corresponent a 1399 milions de parells de nucleòtids de genoma monoploide) als 5,54 pg de R. dichotoma (corresponent a 2709 milions de parells de nucleòtids). Els genomes de major mida era el de les espècies amb un nombre cromosòmic de 9 (5,21 pg/2C), seguides per les de 8 (3,52 pg/2C) i les de 7 (2,92 pg/C). En termes de %GC, el valor més elevat dels estudiats era el de R. gaditana (41,2%) i el més baix el de R. picroides (39,4).
La tinció DAPI visualitza el patró de bandes d’heterocromatina neutra (bandes DAPI+). En R. dichotoma no s’observa cap banda DAPI+. En R. macrophylla tan sols apareixen en dos parells de cromosomes: una banda paracentromerica en el braç 3p i una banda centromèrica en el cromosoma 5. En R. tingitana hi ha bandes centromèriques a tots els cromosomes, a més de bandes paracentromèriques als braços 1p i 3p. A mig camí d’aquests dos extrems, hi ha R. picroides, que tan sols mostra bandes DAPI+ en els centròmers.
Imatges de nuclis cel·lulars de R. dichotoma (A), R. macrophylla (B), R. tingitana (C, D, E), R. gaditana (F), R. picroides (G, H). Els senyals vermelles es corresponen a la presència del gen 5S rDNA; els senyals verds a la del gen 35S rDNA; els senyals grocs a regions genòmiques riques en GC; els senyals blaus a regions d’heterocromatina neutra.
La tinció amb CMA revela la presència de cromatina rica en GC. Les bandes CMA+ són presents en tots els satèl·lits i constriccions secundàries dels cromosomes estudiats. També s’observen bandes addicionals en cromosomes de R. tingitana, R. gaditana i R. picroides.
Pel que fa als gens 35S i 5S:
– R. dichotoma presenta tres loci 35S i un locus 5S (en el braç 1q).
– R. macrophylla presenta dos loci 35S i dos loci 5S (en els braços 3q i 8p).
– R. tingitana presenta dos loci 35S i dos loci 5S.
– R. gaditana presenta un locus 35S i un locus 5S (braç 5p).
A partir d’aquestes distribucions, Siljak-Yakovlev et al. postulen aquest esquema evolutiu:
Pel que fa a la mida de pol·len, aquesta es relaciona amb el nombre cromosòmic. En les espècies de 9 cromosomes, trobem diàmetres equatorials mitjans de 38-40 μm, mentre que en les de 7 cromosomes, aquesta xifra baixa a 32 μm.
Una disploidia decreixent
Les dades filogenètiques i citogenètiques obtingudes per Siljak-Yakovlev els duen a concloure que al gènere Reichardia hi ha hagut una disploïdia descendent. L’ancestre comú de les cinc espècies que han estudiat devia disposar d’un nombre cromosòmic bàsic de 9. Aquest nombre de 9 és de fet considerat com el nombre ancestral de tota la família de les asteràcies o compostes, i també ho seria de la tribu dels cicòries a la qual pertany el gènere Reichardia. Les tres espècies de Reichardia amb un nombre x = 9 presenten unes distribucions geogràfiques típiques d’allò que s’anomena “relictes terciaris”, és a dir associats a refugis quaternaris de la “flora terciària”. Per contra, R. picroides, amb un nombre x = 7, és la que presenta la distribució geogràfica més típicament moderna (circummediterrània).
Cal remarcar que les dues espècies de mida genòmica més elevada, R. dichotoma i R. macrophylla són de caràcter perenne, mentre que les altres tres espècies combinen poblacions perennes amb algunes de biennals i annuals.
Una de les qüestions que obre una situació de disploïdia és l’estat transitori. La meiosi requereix d’un aparellament correcte dels cromosomes i, de fet, aquesta és una de les causes de la infertilitat dels híbrids. En un moment del llinatge devia haver un estat homeòleg transitori, a partir del qual es diferenciarien dues poblacions, la que reté el nombre cromosòmic originari i la que presenta el nou nombre cromosòmic. Hi ha indicis d’aquest procés en les poblacions actuals de R. macrophylla, amb un hàbitat relativament fragmentat, de manera que entre diverses localitats es donen polimorfismes de cariotip.
L’heterocromatina afavoreix la possibilitat de cariotips homeòlegs amb les consegüents ruptures i reestructuraments cromosòmics. Són les espècies intermèdies, de x = 8, les que mostren una major mida de l’heterocromatina.
La disploïdia descendent també s’acompanya d’una reducció del genoma total, i de gens específics (els loci 35S i 5S de rDNA passen de 3 a 1). De fet, en passar de x = 9 a x = 8, hi ha una caiguda rellevant del genoma. Això s’acompanya també d’una disminució en la mida mitjana del gra de pol·len. Les espècies amb x = 8 i x = 7 de Reichardia tendeixen mostrar cicles vitals més curts (annuals, biennals). La disminució de la mida del genoma afavoreix una divisió cel·lular més ràpida, i Siljak-Yakovlev et al. pensen que aquesta seria una de les forces evolutives de la diploïdia descendent de Reichardia.
Lligams:
– Evolutionary implications of heterochromatin and rDNA in chromosome number and genome size changes during dysploidy: A case study in Reichardia genus. Sonja Siljak-Yakovlev, Bernard Godelle, Vlatka Zoldos, Joan Vallès, Teresa Garnatje, Oriane Hidalgo. PLoS One 12(8):e0182318 (2017).
Des de la Mediterrània 