La leishmaniosi cutània és considerada per la Organització Mundial de la Salut com una de les malalties negligides de difusió més incontrolada. Es tracta d’una infecció parasitària, produïda pel protozou Leishmania, i transmesa a través de mosquits del gènere Phlebotomus. Com que Síria és endèmica per a Leishmania tropica i L. major, l’èxode produït arran de la guerra civil iniciada en el 2011 ha contribuït a la difusió de la leishmaniosi cutània en molts altres països de la Mediterrània Oriental. Que sigui una malaltia negligida suposa que no hi ha prou recerca en el desenvolupament de teràpies. Els fàrmacs existents són relativament efectius en casos d’infecció per L. major però no tant contra L. tropica. A més de la qüestió de resistències a aquests fàrmacs, cal tindre present les limitacions degudes a contraindicacions relacionades amb l’edat, l’estat immunitari, etc. La revista PLoS Neglected Tropical Diseases s’adreça a la recerca de malalties com aquesta. Aquesta setmana publicaven una recerca liderada per Hiba El Hajj i Ibrahim Khalifeh, del Departament de Patologia i Medicina de Laboratori de la Universitat Americana de Beirut en el que investiguen l’1-(3-metoxifenil)-N-metilimidazol(1,2-a)quinoxalin-4-amina. Aquesta substància, designada com a EAPB0503 és un anàleg de l’imiquimod. L’imiquimod és una fàrmac immunomodulador especialment actiu contra L. major. En l’article citat, Rana El Hajj et al. estudien l’eficàcia de l’EAPB0503 i de l’imiquimod contra L. tropica i L. major, i els mecanismes moleculars subjacents, emprant com a model macròfags infectats bé amb leishmànies cultivades o amb leishmànies procedents de pacients. Tots dos fàrmacs actuen promovent la resposta immunitària dels macròfags infectats. Per El Hajj els resultats assenyalen que l’imiquimod podria ser efectiu en el tractament de les infeccions per L. tropica, però que EAPB0503 podria ser encara més potent en el tractament de la leishmaniosi cutània.
Cicle vital de “Leishmania major”. La picada del flebòtom permet el bescanvi dels promastigots metacíclics de la sang humana (o d’altres mamífers) i dels amastigots presents en el tub digestiu del mosquit. L’estadi infectiu per a humans són els amastigots, que poden infectar cel·lules del torrent sanguini. El promastigot, que és la forma flagel·lada, permet la invasió activa o passiva (per fagocitosi) de macròfags o granulòcits.
La leishmaniosi cutània
Hiba El Hajj encapçala un laboratori d’oncologia i parasitologia moleculars dins del Department of Pathology and Laboratory Medicine de la American University of Beirut. Hiba El Hajj concebé aquesta recerca sobre l’EAPB0503. L’administració del projecte la va fer ella juntament amb Ibrahim Khalifeh, del mateix Departament.
Rana El Hajj i Hanady Bou Youness, del citat del Departament, i Laurence Lachaud i Patrick Bastien, del Centre Hospitalo-Universitari de la Universitat de Montpelhièr, i Carine Masquefa i Pierre-Antoine Bonnet, de la Facultat de Farmacia de la Universitat de Montpelhièr, participaren en la investigació. Tècnics del Departament de Patologia i Medicina de Laboratori de la Universitat Americana de Beirut realitzaren les tincions de hematoxilina i eosina.
La investigació es finançà a través de la American University of Beirut i del CNRS-Cèdre. Com que una part de la recerca afecta pacients de l’estudi de Rami Mahfouz, l’accés a les dades és limitat.
L’esborrany inicial de l’article fou redactat per Rana El Hajj, i revisat per Hiba El Hajj, amb la col·laboració també de Marwan Eid El Sabban. L’article fou tramès a PLoS el 28 de maig del 2018. L’edició anà a càrrec de Sima Rafati, de l’Institut Pasteur d’Iran, i fou acceptat el 18 de setembre i publicat el 21 de novembre.
La leishmaniosi cutània és una malaltia negligida i, potser per això mateix, és una malaltia en expansió. Si en el 2002 la incidència mundial era de 2,1 milions de casos, en el 2015 s’estimava en 4 milions. La malaltia és endèmica a Síria, i subendèmica al Líban. Com a conseqüència dels desplaçaments associats a la guerra civil inciada en el 2011, la prevalença es duplicà a Síria: el corrent de refugiats als països veïns ha contribuït també a escampar aquesta parasitosi.
Entre els tractaments utilitzats a la Mediterrània Oriental uns dels més utilitzats és l’antimoniat de meglumina (comercialitzat com a Glucantime), que requereix injeccions doloroses en les lesions cutànies que es repeteixen setmanalment fins a dos mesos. Com a alternativa a les injeccions intra-lesionals s’ha proposat la injecció intramuscular, però aquesta via presenta un risc hepatotòxic i cardiotòxic. L’OMS també contempla el tractament amb imiquimod, combinat amb antimonials sistèmics.
L’imiquimod és una fàrmac de la família de la imidazolquinoxalines desenvolupat contra infeccions cutànies. L’imiquimod presenta activitats anti-virals i anti-tumorals. En alguns models de càncer, un anàleg de l’imiquimod, l’EAPB0503 (1-(3-metoxifenil)-N-metilimidazo[1,2-a]quinoxalin-4-amina) resulta encara més potent. Per això, el laboratori d’El Hajj decidí estudiar totes dues substàncies com a agents contra els estadis amastigots de L. tropica i L. major, especialment pel que fa al mecanisme d’acció.
Una metodologia in vitro
Com a cultius empraren les línies MHOM/MA/81/LEM265 i MMER/MA/81/LEM309 de Leishmania major i les MHOM/LB/76/LEM61 i MRAT/IQ/72/ADHANIS1 de Leishmania tropica, adquirides a través del CRHU de Montpellier. Aquestes línies eren mantingudes en un medi RPMI1640 suplementat amb sèrum fetal boví, i protegit amb estreptomicina i penicil·lina.
L’Imiquimod ja és comercialitzat, però l’EAPB0503 era sintetitzat pel laboratori de Carine Masquefa.
A partir de la línia cel·lular humana de monòcits THP-1, obtenien macròfags amb l’exposició a acetat-miristat de forbol. Els macròfags així obtinguts eren activats amb exposició al lipopolisacàrids, i llavors se’ls infectava amb L. major o L. tropica a una raó de 5 paràsits per cada macròfag.
També s’isolaren promastigots frescos de L. tropica a partir de biòpsies de lesions de tres pacients amb leishmaniosi cutània tractats a Beirut en el 2016. Com que es tractava de tres infants, el consentiment informat de la cessió de mostres el feren els progenitors respectius. La caracterització d’aquests paràsits es va fer a través d’una PCR de la seqüència ITS1 i l’anàlisi de longitud de fragments de restricció.
Així doncs, els macròfags de cultiu cel·lular eren exposats bé a leishmànies de cultiu o procedent de pacient. Diferents cultius eren exposats simultàniament a diferents concentracions d’imiquimod i de EAPN0503. Per seguir l’activitat anti-amastigot es feia una extracció d’ARN i es valorava per qRT-PCR la presència de l’ADN minicircular del cinetoplast (kDNA), emprant com a control els gens GAPDH i i-NOS.
Els sobrenedants dels cultius exposats eren analitzats per enzimo-immunosassaig per valorar tota una sèrie de citocines i quimiocines: IL-12, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IL-10 i IL-4.
A través d’immunofluorescència i microscòpia confocal se seguiren en alguns cultius exposats l’expressió de la subunitat p65 de la NF-κB i de la Gp63. Els cultius també foren observats al microscopi amb tincions hematoxilina-eosina i Giemsa.
Els nivells de NF-κB p65 i de p52 també foren seguits amb un Western blot dels macròfags infectats.
Potència i mecanisme d’acció d’EAPB0503
Tant l’imiquimod com l’EAPB0503 aconseguien un màxim del 80% d’inhibició de la replicació L. major en el cultiu de macròfags. Aquest màxim d’inhibició s’assolia a una concentració de 1 μM.
Pel que fa a L. tropica, l’EAPB0503 mostrava una eficàcia inhibitòria a 0,1 μM comparable a l’eficàcia de l’imiquimod a 1 μM. Aquest resultat és particularment prometedor, ja que L. tropica és l’espècie més endèmica a la Mediterrània Oriental en la leishmaniosi cutània antroponòtica (la que circula entre humans i mosquits, sense passar per reservoris de mamífers d’altres espècies)
L’EAPB0503 mostra una major eficàcia contra la replicació d’amastigots de “L. tropica” que l’imiquimod
Se sap que l’imiquimod és un agonista dels receptors TL (TLR) i que té una alta afinitat per TLR7, receptor implicat en el reconeixement de patògens. El Hajj et al. mostren en el seu model in vitro d’infecció de macròfags amb L. tropica que tant l’imiquimod com l’EAPB0503 augmenten els nivells de TLR7.
A través de l’anàlisi de Western Blot, El Hajj et al. ressegueixen la via de senyalització que inicien els TLRs. Aquesta via de senyalització inclou l’activació de l’NF-κB. Comproven que efectivament l’imiquimod i l’EAPB0503 indueixen la via canònica de senyalització de l’NF-κB: activació del complex IKKα/IKKβ, inducció de la forma fosforilada de IκBα, translocació al nucli de la subunitat p65. Aquesta via de senyalització condueix a l’activació de gens de resposta immune, i és a través de la resposta immune del propi macròfag que es vehicula l’acció leishmanicida d’aquests dos fàrmacs.
El Hajj et al., de fet, investiguen els mediadors de la resposta immunitària del macròfag. Així doncs, observen que tant l’imiquimod com l’EAPB0503 augmenten els nivells de MIP-1α, MIP-1β i MCP-1. També hi ha un augment de la secreció de citocines inflamatòries (IL-12, IL-1β, TNF-α i IL-6). Algunes d’aquestes citocines indueixen la i-NOS, amb la corresponent síntesi de monòxid de nitrogen (NO). Paral·lelament, hi ha una reducció dels nivells de citocines antiinflamatòries (IL-10 i IL-4).
L’eficàcia davant de cultius primaris de Leishmania tropica
El gros dels experiments d’El Hajj et al. es feren amb leishmànies cultivades. També en feren experiments amb leishmànies isolades en biòpsies de lesions de tres infants que patiren leishmaniosi cutània en el 2016. En aquests tres casos es tractava de Leishmania tropica. En aquests estudis es comparava l’efecte de l’imiquimod i de l’EAPB0503 amb el de la Glucantime, així com el de la combinació de la Glucantime i l’imiquimod. Dels diferents tractaments, el que oferia una resposta in vitro més destacada era l’EAPB0503, amb una reducció de la transcripció de kDNA del 70% a les 10h i del 80% a les 24h.
EAPB0503 també mostra una major eficàcia davant de “L. tropica” isolada de pacients amb leishmaniosi cutània
L’eficàcia de l’EAPB0503 era també confirmada histològicament i per microscòpia confocal d’immunofluorescència (on la tinció de Gp63 és un indicador de la presència d’amastigots). Pel que fa al mecanisme d’acció, també en aquest cas es registrava una augment de la transcripció de TLR7 i de i-NOS.
Noves perspectives per al tractament de la leishmaniosi cutània
El problema dels tractaments actuals amb compostos d’antimoni pentavalent és el cost elevat d’aquests fàrmacs i la manca de disponibilitat, però també cal assenyalar l’augment de les resistències així com la toxicitat sistèmica (que obliga a doloroses injeccions intralesionals). D’altra banda, el tractament és més efectiu en L. major que no pas en L. tropica. Entre els casos de leishmaniosi cutània en refugiats sirians del Líban es calcula que el 85% es deu a L. tropica i el 15% a L. major.
Certament, l’estudi d’El Hajj et al. és purament in vitro, centrat en l’acció dels fàrmacs sobre la proliferació d’amastigots que infecten macròfags en cultiu. Però ofereix no tan sols dades sobre l’efectivitat de l’imiquimod i de l’EAPB0503 sinó també sobre els mecanismes de la seva acció leishmanicida. En tots dos casos el mecanisme d’acció és mediat per TLR7 (encara que en EAPB0503 també podrien actuar altres receptors TLRs). Aquests receptors desencadenen la via canònica de NF-κB que condueix a l’alliberament de citocines proinflamatòries i a la inducció de l’activitat NO-sintasa. Dit d’una altra manera, l’imiquimod i l’EAPB0503 estimulen la capacitat leishmanicida del propi macròfag infectat.
La conclusió principal és la potencialitat d’EAPB05030 com a fàrmac contra la leishmaniosi cutània. Correspondrà a altres grups de recerca desenvolupar aquesta línia terapèutica. El Laboratori d’El Hajj, paral·lelament, considera necessari aprofundir en el mecanisme d’acció, la qual cosa passa per explorar el rol d’altres TLRs (TLR2, TLR4 i TLR9) i per també escatir la participació del NO i d’altres espècies reactives de l’oxigen i del nitrogen en l’acció leishmanicida.
Lligams:
– EAPB0503: An Imiquimod analog with potent in vitro activity against cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania major and Leishmania tropica. Rana El Hajj, Hanady Bou Youness, Laurence Lachaud, Patrick Bastien, Carine Masquefa, Pierre-Antoine Bonnet, Hiba El Hajj, Ibrahim Khalifeh. PLoS Negl. Trop. Dis. 12:e0006854 (2018).
Des de la Mediterrània 