A la Mediterrània Occidental la família dels espàrids és representada per la boga (Boops boops), el pagell (Pagellus erythrinus), el calet (Pagellus acarne), el déntol (Dentex dentex) o el pagre (Pagrus pagrus). En les brànquies de totes aquestes espècies podem trobar cucs ectoparàsits. És el cas el gènere de cucs plans Microcotyle, que si bé comença el seu cicle vital amb una larva de vida lliure (l’oncomiracidi) no tanca el seu desenvolupament fins a haver arribat a l’edat adulta com a paràsit de les brànquies d’aquests peixos. Hom ha descrit més d’un centenar d’espècies de Microcotyle, d’acord amb característiques morfològiques. Els estudis genètics, no obstant, indiquen que aquesta classificació morfològica potser no representaria de manera exacta les relacions evolutives entre elles. Per exemple, entre Microcotyle erythrini i altres espècies properes no hi ha pràcticament diferències morfològiques. Aquesta espècie fou descrita el 1863 per Van Beneden & Hesse en el pagell, però quan se l’ha trobada en les brànquies d’altres espècies d’espàrids, sorgeix el dubte si no es tracta d’una espècie críptica diferent de paràsit. Aquesta qüestió taxonòmica ha estat investigada per la Unitat de Zoologia Marina de l’Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva (ICBiBE), centre adscrit a la Universitat de València amb seu al Parc Científic de Paterna. En un article a la revista Parasites & Vectors, María Villora-Montero et al. opten per fer una redescripció de M. erythrini en un sentit més restringit i per descriure com a espècie diferent la variant que infesta el déntol. Fonamenten aquesta proposta en la caracterització molecular i morfològica que han fet dels paràsits de brànquies de les cinc espècies d’espàrids que hem esmentat més amunt. La filogènia d’aquests paràsits ha estat reconstruïda a través de l’amplificació dels dominis D1-D3 del gen de l’ARNr 28S i de la subunitat 1 de la citocrom c oxidasa. És així que troben com a millor classificació la de tres espècies: M. erythrini (com a paràsit de P. erythrinus i Pa. pagrus), M. isyebi (com a paràsit de B. boops) i M. whittingtoni (com a pàrasit de D. dentex). És aquesta tercera l’espècie “nova” que descriuen en l’article. La diferenciació morfològica la fan d’acord amb les dimensions de l’haptor i dels seus lòbuls (l’òrgan que permet al paràsit d’aferrar-se a la brànquia), el gruix de les pinses, la mida i la forma de les espines de l’atri genital, l’extensió de les extremitats posteriors dels camps vitel·lins i la forma dels filaments d’ous. No serien, doncs, estrictament espècies críptiques des d’un punt de mira morfològic. Ara bé, per garantir una bona identificació és necessari disposar d’espècimens ben preservats.
Proposta de classificació dels microcòtils que infesten brànquies dels espàrids de la Mediterrània Occidental
La descripció de Microcotyle erythrini
Maria Víllora-Montero fa la tesi doctoral en la Unitat de Zoologia Marina de l’ICBIBE, centre adscrit a la Universitat de València. Fou ella qui concebé l’estudi, obtingué les mostres, emprengué la caracterització morfològica i realitzà els dibuixos. Ana Pérez-del-Olmo, professora d’aquesta unitat, co-dissenyà i planificà el projecte, realitzà l’anàlisi morfomètrica multivariada, i contribuí a redactar el primer esborrany de l’article. Simona Georgieva, de la mateixa unitat, i Víllora realitzaren les seqüenciacions, les anàlisis filogenètiques i contribuïren a la discussió taxonòmica de l’article. El professor de zoologia Juan Antonio Raga intervingué en la discussió dels resultats i la preparació de l’article. El professor de l’ICBiBE Francisco Esteban Montero Royo coordinà i co-dissenyà el projecte; intervingué en la redacció del primer esborrany de l’article i de la seva estructura general.
La recerca fou finançada amb projectes del Ministerio de Economía amb fons FEDER, i de la Generalitat Valenciana. Georgieva té una beca post-doctoral Juan de la Cierva.
Els autors agraeixen els consells de la professora Aneta Kostadinova, de l’Acadèmia Búlgara de Ciències. També agraeixen a Natalia Fraija l’ajut en l’aplicació de tècniques d’anàlisi molecular.
La redacció en anglès fou revisada per Rachel V. Pool. Pérez del Olmo presentà l’article a Parasites & Vectors el 7 d’agost del 2019. Els revisors feren tota una sèrie de comentaris i suggeriments. Fou acceptat l’1 de gener del 2020, i publicat el dia 31.
Microcotyle erythrini fou descrita per van Beneden & Hesse el 1863 en un exemplar de Pagellus erythrinus capturat davant del litoral de Brest. Parona & Perugia la mantingueren en la seva revisió del gènere Microcotyle del 1890, i també ho fan investigadors actuals. El gènere Microcotyle defineix la família dels microcotílids, inclosos en la classe “Monogenea” (els anomenats “trematodes monogenis”). En la descripció del 1863, M. erythrini era definit pel nombre de pinses i de testicles, i per la morfologia de l’atri genital. Hom ha classificat dins d’aquesta espècie altres espècimens trobats en altres espècies d’espàrids. Les dades moleculars (gen cox1), però, conviden a diferenciar els espècimens trobats en Boops boops en una altra espècie, M. isyebi.
Víllora-Montero et al. volien contribuir a esclarir la taxonomia del gènere Microcotyle en els espàrids que viuen en el litoral espanyol de la Mediterrània Occidental. És per això que descriuen com una espècie diferenciada la que parasita a Dentex dentex. També presenten els detalls morfològics que ajudarien a la determinació de nous espècimens.
Una col·lecció de 150 peixos
Les mostres d’espàrids foren obtingudes a través de Francisco Piedecausa, de Hermanos Narejo S.L., empresa de Guardamar del Segura. Les captures les feren pesquers comercials d’arrossegament els mesos de juliol del 2012 i del 2013, davant de la costa de Guardamar. Els peixos eren transportats al laboratori en gel, on els pesaven i mesuraven. En total s’examinaren 150 peixos de quatre espècies diferents d’espàrids: 40 bogues (Boops boops), 40 pandores comunes (Pagellus erythrinus), 40 déntols (Dentex dentex) i 30 pagres roigs (Pagrus pagrus). Addicionalment, s’examinaren 40 espècimens de P. acarne).
L’exam consistia en una dissecció de les brànquies, seguida de la inspecció, sota estereomicroscopi, de la presència de paràsits. S’hi collien tots els paràsits, que eren rentats en una solució salina del 0,9%.
Els espècimens adults i completament madurs de Microcotyle spp. que es trobaven en condicions òptimes (ni trencats, ni contrets, ni tibats, ni arrugats, ni plegats), eren apartats per les anàlisis morfològiques. Se’ls fixava en una solució de formaldehid del 4% durant quatre dies, i se’ls transferia després a pots d’etanol del 70%.
Per a les anàlisis moleculars se seleccionaven altres espècimens frescos. De cada espècimen es comptaven testicles i pinces, i se’l fotografiava. Seguidament l’espècimen era tallat en tres trossos, conservant-hi l’anterior i el posterior per a les proves molecular, mentre que el tros central era fixat i preservat en etanol.
Hom calculava la prevalença, és a dir el percentatge de peixos infectats, així com la intensitat mitjana (el nombre mitjà de paràsits per hoste).
Seqüenciació i anàlisi filogenètica
Dels espècimens preservats en etanol es feia una extracció d’ADN genòmic.
Els encebadors utilitzats per a la PCR de cox1 eren 5′-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3′ i 5′-AAA GAA AGA ACA TAA TGA AAA TG-3′.
Els encebadors utilitzats per a la PCR de 28S eren 5′-TAG GTC GAC CCG CTG AAY TTA AGCA-3′ i 5′-TAG AAG CTT CCT GAG GGA AAC TTC GG-3′.
Els amplicons obtinguts eren purificats, i tramesos a Macrogen Europe Inc., on feien la seqüenciació.
Les seqüències obtingudes eren arrenglerades amb les seqüències ja publicades a GenBank. Així, de cox1 hi havia 12 seqüències noves a comparar amb les 20 ja presents a la base de dades (corresponents a 10 espècies diferents). S’utilitzà la seqüència de Bivagina pagrosomi com a referent extern.
Pel que fa a 28S, les 4 seqüències noves foren comparades amb 10 ja presents a la base de dades, de nou amb B. pagrosomi com a referent extern.
L’anàlisi morfològica
Els espècimens reservats a l’anàlisi morfològica eren tenyits amb acetocarmí de ferro, deshidratats amb una sèrie ascendent de solucions etanòliques, aclarits amb ftalat de dimetril i preparats en bàlsam de Canadà. Una vegada preparats, es feia una nova selecció per descartar espècimens trencats, contrets, estirats, arrugats o plegats. Els espècimens eren examinats en un microscopi òptic de contrast d’interferència diferencial.
En total se seleccionaren 86 espècimens, 22 procedents de B. boops, 21 de D. dentex, 23 de P. erythrinus i 20 de Pa. pagrus. Els 86 espècimens eren dibuixats amb un assistent vinculat al propi microscopi. Les il·lustracions eren després digitalitzades i analitzades d’acord amb un total de 52 mesures morfomètriques.
Les principals característiques diagnòstiques es troben en els òrgans que permeten l’adhesió al tegument branquial, és a dir pinces i haptor
La descripció de Microcotyle whittingtoni
Víllora-Montero defineixen com a espècie nova Microcotyle whittingtoni, a partir d’espècimens trobats en brànquies de Dentex dentex. L’holotip ((NHMUK.2019.12.10.1) i tres paratips han estat dipositats en la col·lecció del Natural History Museum de Londres. La resta de materials (17 espècimens) han estat dipositats a la Col·lecció Parasitològica de l’Institut Cavanilles, a Paterna.
Dibuixos de “Microcotyle whittingtoni”
M. whittingtoni era present en 23 dels 40 déntols (prevalença del 58%), amb una intensitat mitjana de 4,36 ± 5,18 paràsits per peix.
L’adjectiu whittingtoni és un homenatge a Ian David Whittington (1960-2014).
Les dues altres espècies
Víllora-Montero et al. fan una redefinició de Microcotyle erythrini, de caràcter més estricte. En el seu estudi, M. erythrini era present en 21 dels 40 P. erythrinus, i en 14 dels 30 Pa. pagrus. En total, han recuperat 43 adults madurs, dels quals han tramès 6 espècimens al NHM de Londres.
Víllora-Montero et al. confirmen la descripció de Microcotyle isyebi que feren l’any passat Bouguerche, Gey, Justine & Tazerouti a Algèria. En Boops boops assoleixen una prevalença del 70% (28 dels 40 peixos examinats).
El llegat de Whittington
Whittington era expert en els monogenis. Els monogenis són una classe de cucs plans (platelmints) que són tots ells ectoparàsits de peixos. Tenen un cicle vital directe. Els adults viuen en el tegument, les brànquies o les aletes de peixos; són hermafrodites, i hi ha espècies ovípares o vivípares. En el cas de Microcotyle els adults són ovípars, i els ous són alliberats al medi aquàtic: allà eclosionaran i faran el primer estadi larvari, per bé que només progressaran més enllà d’aquest estadi si troben un nou hoste. Per tal de no deixar escapar el seu hoste, cosa que els implicaria la mort, disposen de tot un aparell per fixar-s’hi. Són aquests òrgans els que permeten diferenciar espècies que, altrament, semblen gairebé idèntiques. Whittington defensava la necessitat de disposar d’espècimens el més ben conservats possibles, i que la identificació recolzàs alhora en les anàlisis de genètica molecular.
Víllora-Montero et al. descriuen la diversitat de microcòtils en els espàrids de Guardamar en tres espècies. En aquest sentit, defensen una redefinició més estricta de M. erythrini, alhora que reconeixen per primera vegada que aquesta espècie pot infestar Pa. pagrus. També reconeixen la presència a Guardamar de M. isyebi, una espècie que fins ara sols s’havia descrit al litoral algerià. La tercera espècie seria una espècie de nova descripció, M. whittingtoni.
En aquestes tres espècies, les diferències morfològiques i de rang d’hoste, s’acompanyen també d’una diferenciació molecular, visible en la seqüència de cox1. De les tres espècies, la més diferenciada molecularment és M. whittingtoni.
La literatura reconeix actualment més de 100 espècies de Microcotyle. Víllora-Montero et al. ofereixen una sèrie de criteris morfològics que ajudarien a esclarir la validesa de totes aquestes classificacions.
Lligams:
– Considerations on the taxonomy and morphology of Microcotyle spp.: redescription of M. erythrini van Beneden & Hesse, 1863 (sensu stricto) (Monogenea: Microcotylidae) and the description of a new species from Dentex dentex (L.) (Teleostei: Sparidae). María Víllora-Montero, Ana Pérez-del-Olmo, Simona Georgieva, Juan Antonio Raga & Francisco Esteban Montero. Parasit. Vectors 13: 45 (2020).
Des de la Mediterrània 