Ara fa unes setmanes parlàvem d’un cas de meningitis vírica provocat pel virus Toscana (21/2026). El diagnòstic d’una infecció pel virus Toscana (TOSV) no és fàcil degut a la manca d’eines serològiques. La tesi doctoral de Laura Dionisi, de la Università di Bologna, tracta sobre la producció de la proteïna N del TOSV com a diana serològica. En un article al Journal of Virological Methods expliquen els passos des d’un ensamblatge de Gibbon a una expressió en un sistema acel·lular. En les infeccions per TOSV la proteïna N s’acumula en les cèl·lules infectades i és una diana primària per al sistema immunitari del pacient.
Dionisi et al. han desenvolupat un sistema acel·lular de síntesi proteica per a produir la nucleoproteïna del virus Toscana en 16 hores.
La proteïna N del virus Toscana
El virus Toscana (Phlebovirus toscanaense) és classificat dins de la família del Phenuiviridae, dins de l’ordre Bunyavirales. Els flebovirus són virus esfèrics amb embolcall lipídic. El genoma consisteix en ARN monocatenari i de sentit negatiu, disposat en tres segments:
– un segment gros (L), que codifica una ARN polimerasa ARN-dependent.
– un segment mitjà (M) que codifica glicoproteïnes d’embolcall.
– un segment petit (S) que codifica la nucleoproteïna (proteïna N).
Dins del gènere Phlebovirus s’han descrit 10 espècies, que inclouen més d’un centenar de serovariants. Des d’un punt de mira ecològic cal diferenciar entre els que es transmeten per mosques areneres (flebòtoms) i els qui ho fan per paparres. Els virus de la febre del flebòtom es classifiquen en tres serotips, que han rebut denominacions geogràfiques: sicilià (SFVS), napolità (SFVN) i toscà (TOSV). La infecció per TOSV normalment cursa limitadament amb febre, miàlgia i mal de cap, però pot complicar-se si afecta el sistema nerviós central produint-hi meningitis o meningoencefalitis. Allà on el TOSV és endèmic, la seroprevalença pot enfilar-se al 6-25%, i hom calcula que més de 250 milions de persones que la regió mediterrània hi són exposades.
S’han identificat tres llinatges de TOSV: A, B i C. El llinatge A circula per Itàlia. El diagnòstic de la infecció per TOSV es pot realitzar per la detecció molecular del virus o per tests serològics. Per al diagnòstic serològic hi ha els kits comercials Sandfly fever virus Mosaic 1 IIFA (EUROIMMUN), recomLine Bunyavirus IgG/IgM immunoblot (Mikrogen) i Enzywell TOSV IgG/IgM ELISA (DIESSE).
L’antigen viral més rellevant per al TOSV és la nucleoproteïna o proteïna N. Ho és tant pel que fa a estructura, funció i immunogenicitat. La proteïna N és codificada per una seqüència de 759 pb del segment S del genoma víric. El producte gènic és una proteïna no-glicosilada de 253 aminoàcids. Aquesta proteïna N s’associa al genoma viral d’ARN i, juntament, amb la RdRpolimerasa forma les ribonucleoproteïnes virals. La proteïna N és la més proteïna més abundant en les partícules víriques (=virions) i en les cèl·lules infectades. La majoria d’anticossos IgM i IgG de la població humana que s’adrecen contra TOSV ho fan contra la proteïna N.
La proteïna N és altament conservada en les múltiples soques de TOSV isolades de mostres humanes i de flebòtoms.
L’objectiu de Dionisi et al. era l’obtenció d’una proteïna N recombinant. Les tecnologies d’ADN recombinant són una alternativa a la purificació de mostres naturals o de cultiu de laboratori. La síntesi acel·lular de proteïnes és una opció per a produir proteïnes en poques hores amb prou puresa per fer-les servir com a material de referència d’assaigs diagnòstics.
El primer pas de les tecnologies d’ADN recombinant és l’obtenció d’un plàsmid recombinant que contingui el gen d’interès. La selecció del tipus de plàsmid depèn de la longitud i complexitat del gen, però també dels vectors, tags i sistemes d’expressió que es faran servir.
La clonació de gens arrenca fa uns 50 anys, amb la utilització d’endonucleases de restricció i ligases. Actualment, la síntesi d’ADN de novo és prou competitiva per fornir una alternativa a la clonació clàssica. El sistema Gibson® Assembly, desenvolupat en el 2009, es basa en la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), l’ensamblatge in vivo i la clonació, és a mig camí de les dues estratègies.
Dionisi et al. empraren Gibson® Assembly per clonar de forma eficient el gen d’interès en el plàsmid de Thermo ScientificTM, pT7CFE1-Chis. El pT7CFE1-Chis és un vector de 3,5 kpb optimitzat per a sistemes d’expressió acel·lulars. Disposa d’un tag C-terminal de sis histidines (His6). El Thermo Scientific™ 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit permet generar llavors un antigen recombinant TOSV N.
De la natura al laboratori
Dionisi et al. empraren cèl·lules Vero E6 (ATCC CRL 1585). El material víric és un cinquè passatge de la soca RN_050724 de TOSV, que procedeix d’un aïllat de fluid cerebrospinal d’un pacient positiu confirmat. Aquesta soca pertany al llinatge A, i el seu genoma ha estat seqüenciat. Dionisi et al. exposaren cèl·lules Vero al TOSV RN_050724, monitoritzant diàriament la infecció per l’efecte citopàtic. La cinètica de la infecció era avaluada diàriament per RT-PCR.
Al cap de 72-96 hores d’infecció, Dionisi et al. recollien mostres de sobrenedant del cultiu, de les quals feien extracció d’ARN. L’extracte d’ARN era retrotranscrit a cDNA amb una retrotranscriptasa.
Dionisi et al. dissenyaren els encebadors necessaris per a Gibson® Assembly. Aquests encebadors permetran l’amplificació de l’insert i del plàsmid linealitzat. Segueix el pas de clonació, consistent en la introducció de l’insert en el plàsmid circularitzat. El resultat és el material amb el qual es fa la transformació de bacteris Escherichia coli DH5α. Els bacteris transformats són seleccionat en plaques d’agar amb ampicil·lina.
Dionisi et al. comprovaren la presència de la seqüència clonada en les colònies bacterianes transformades. Aquestes colònies són la base de l’amplificació i extracció del plàsmid recombinant. El sistema d’expressió empra 4000 ng de plàsmid recombinant, amb una incubació a 30 °C durant 16 hores. Segueix un procés de purificació de proteïna en columna que aprofita la cua d’histidines de la proteïna recombinant. La proteïna resultant fou analitzada per la tècnica del Blau de Coomassie i per Western blot (amb l’Ig G 022A-05254, EVA-G).
Proteïna N-TOSV recombinant
Dionisi et al. reeixiren en la síntesi del vector pT7CFE1-CHis recombinat amb el gen N de TOSV. Val a dir que trobaren necessari el pas de purificació en gel d’agarosa posterior a la PCR. Utilitzar gels prims d’agarosa els permeté d’assolir una concentració de >35 ng/μL per al plàsmid i de >20 ng/μL per l gen N.
La transformació bacteriana generà 58 colònies en la placa selectiva d’Agar. Se’n van fer PCR colonials per a 30 colònies, de les quals resultaren positives per al gen N recombinant 10. Diverses d’aquestes deu colònies foren crescudes 16 hores per fer-ne una extracció de plàsmids. Una d’aquestes colònies fou triada per a escalar la producció de plàsmid. El plàsmid recombinant no presentava mutacions en el gen N.
La purificació en columna generava una proteïna en quantitat satisfactòria.
Del laboratori a l’aplicació clínica
Dionisi et al. han desenvolupat, doncs, un protocol eficient i optimitzat per a la producció de proteïna N-TOSV. Aquesta producció s’enfoca al diagnòstic serològic de la infecció per TOSV. Val a dir que el procediment que utilitzen es pot aplicar contra qualsevol proteïna d’interès. De fet, també pot servir per a produir un ventall de proteïnes recombinants per a la caracterització funcional o estructural.
El sistema d’expressió que utilitzen Dionisi et al. deriva d’extracte de cèl·lula HeLa. Aquest extracte conté la maquinària ribosomal de síntesi proteica i la maquinària de glicosilació del reticle endoplàsmic i l’aparell de Golgi. La proteïna N recombinant que obtenen té un pes molecular de 25 kDa.
Ara bé, el rendiment de producció de proteïna és massa baix com per fer-lo servir a gran escala. Actualment els sistemes d’expressió cel·lular ofereixen rendiments superiors.
Lligams:
– From Gibson Assembly to Cell-Free Expression: a guide to Recombinant Plasmid and Toscana Virus N Protein Production. Laura Dionisi, Alessandra Mistral De Pascali, Ludovica Ingletto, Giada Forlani, Gianni Gori Savellini, Massimiliano Guerra, Martina Brandolini, Claudia Colosimo, Giulia Gatti, Willian Cardoso Ferreira, Laura Grumiro, Giorgio Dirani, Silvia Zannoli, Maria Grazia Cusi, Monica Cricca, Alessandra Scagliarini, Vittorio Sambri. J. Virol. Methods (2026).
Des de la Mediterrània 
Podeu escriure el vostre comentari aquí: