La microbiota intestinal de nou tortugues caretes que vararen en el litoral de Sicília (Microbiologia mediterrània, 33/2019)

Les tortugues varen quan deixen de nedar, bé sigui perquè són malaltes o perquè han patit ferides. En deixar de nedar, l’onatge les arrossega fins a la costa. La tortuga marina més habitual a la Mediterrània, la tortuga careta o babaua (Caretta caretta), és també la protagonista més habitual d’aquest fenomen. A la Mediterrània cada any es registren centenars de tortugues varades que es poden atribuir a activitats antropomòrfiques. Algunes de les tortugues varades tenen la sort d’ésser trobades en vida i traslladades a centres de recuperació de la fauna marina o de la fauna salvatge en general. Marco Arculeo, del Departament de Ciències i Tecnologies Biològiques, Químiques i Farmacèutiques de la Università degli Studi de Palermo, considera que la caracterització del microbioma digestiu d’aquestes tortugues pot ajudar a orientar les teràpies de rehabilitació d’aquests animals. Amb altres col·legues del seu departament i del també palermità Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia (IZS), han analitzat la composició filogenètica de la flora bacteriana digestiva de nou exemplars varats en diferents punts del litoral sicilià. Les mostres de vuit tortugues s’obtingueren en la primera setmana de la seva estada en un centre de recuperació, i la de la novena s’obtingué quan ja feia 78 dies que s’hi estava. Les dades obtingudes les comparen amb la de microbiota fecal de tortugues varades en punts del litoral de la Toscana i de la Ligúria. Troben que els principals components de la microbiota són firmicutes, bacteroidetes i proteobacteris.

Exemplar de tortuga careta

Microbioma fecal de tortugues varades

Marco Arculeo, del Departament STEBICEF de l’Univirsitati di Palieimmu concebé aquesta recerca sobre el microbioma intestinal de tortugues varades. La metodologia anà a càrrec de Giulia Sciurba (STEBICEF), Flavia Berlingheri (de l’STEBICEF, però que ara és a l’Institut de Ciències Evolutives de la Vida de Groningen) i Antonio Gentile (de l’IZS). En l’obtenció de dades participaren Vincenzo Arizza (STEBICEF), Luca Vecchioni (STEBICEF), Maria Flaminia Persichetti (IZS) i Rosa Alduina (STEBICEF). La investigació anà a càrrec de Santo Caracappa (IZS) i Sciurba. L’anàlisi formal fou realitzada per Vecchioni. Alduina validà les dades.

La investigació fou finançada amb fons de la Universitat de Palerm, amb programes dirigits per Alduina, Arculeo i Arizza. També rebé fons del Projecte Bythos.

Amb data de 17 de juliol del 2018, les dades metagenòmiques eren entrades a GenBank sota el projecte PRJNA481425.

L’article original fou redactat per Vecchioni, Arculeo i Alduina. Alduina el trameté a PLOS el 4 de març del 2019. L’edició anà a càrrec de Roberta Cimmaruta, de la Università degli Studi della Tuscia. En el procés de revisió per a la redacció final participaren Berlinghieri, Arculeo i Alduina. L’article fou acceptat el 12 de juliol i publicat el 14 d’agost.

La microbiota digestiva és la comunitat ecològica de microorganismes que resideix en tracte gastrointestinal. El punt de partida d’Arculeo és que aquesta microbiota influeix en la fisiologia, immunitat i desenvolupament dels animals. El desenvolupament d’una nova generació de tècniques de seqüenciació fa possible, a través de la caracterització del gen ribosòmic 16S, conèixer la composició taxonòmica d’aquesta microbiota. L’anàlisi genòmica agregada de la microbiota es manifesta en una metagenoma microbià o microbioma. La informació genètica del metagenoma de la microbiota gastrointestinal es desenes de vegades superior a la informació genètica del propi hoste, i això reflecteix la diversitat d’enzims microbians i dels processos biològics sustentats per ells, que participen de manera decisiva en la digestió d’aliments i la producció d’energia.

S’ha dit de vegades que la microbiota intestinal és el tema més intensament investigat en el camp de l’ecologia microbiana. Però en els darrers anys l’interès ha augmentat en prendre’s major consciència del rol d’aquestes comunitats microbianes en l’homeostasi digestiva, en la regulació metabòlica general i en la defensa contra microorganismes patògens. I allò que s’havia descobert en mamífers domèstics i en humans, es trasllada, de vegades de manera fins i tot més clara, en altres grups de vertebrats.

Arcuino volia explorar en aquest sentit la rellevància de la microbiota intestinal en les patologies associades a la tortuga careta (Caretta caretta L.). Aquesta és l’espècie de tortuga marina més abundant a la Mediterrània, i cal matisar la qüestió d’abundant, car no hem d’oblidar que si altres espècies es troben en greu perill, la tortuga careta és considerada una espècie vulnerable per la IUCN. La raó d’aquesta vulnerabilitat és complexa: captures accidentals per vaixells de pesca, la contaminació d’aigües marines, canvis climàtics globals, etc. Algunes d’aquestes causes promouen que les tortugues quedin varades en el litoral. Les tortugues varades que són identificades encara amb vida, són conduïdes a centres de recuperació i, si el tractament reïx, són reintroduïdes a la mar.

Khaled F. A. Abdelrhman, i altres investigadors de la Toscana, foren pioners en el 2016 en l’estudi de la microbiota digestiva de la tortuga careta (Abdelrhman et al., 2016). Arizza et al., de fet, agraeixen a aquests investigadors haver compartir les dades obtingudes, consistents en el microbioma de quatre mostres fecals de tres espècimens i de sis mostres cloacals d’uns altres cinc individus. Aquest i altres estudis mostren una diferència en la composició taxonòmica de la microbiota intestinal de la tortuga careta (que és una tortuga carnívora, que s’alimenta de mol·luscs, crustacis, peixos, meduses, etc.) respecte de la tortuga verda (Chelonia mydas, que s’alimenta d’herbes marines i de macroalgues).

Arizza et al. recolliren mostres fecals de nou espècimens de tortuga careta que havien varat en diferents punts del litoral sicilià: tres a Catania, una a Porto Rosso (Catania), dos a Augusta (Siracusa), una a Pozzallo (Ragusa), una a Pantelleria (Trapani) i una a Terrasini (Palermo). Les mostres es recolliren entre l’agost del 2017 i el setembre del 2018. Vuit de les mostres es recolliren entre 2 i 7 dies després que les tortugues haguessin traslladades al Centre Regional de Recuperació de Tortugues Marines de l’IZS de Palerm. En una de les tortugues recollides a Catania, les mostres es prengueren quan l’animal feia 78 dies que era al centre de recuperació i era a punt d’ésser reintroduït en el mar.

Al Centre de Recuperació de l’IZS de Palerm, les tortugues marines són acollides en tancs separats d’aigua marina. Abans de col·locar-hi un nou animal els tancs són rentats i desinfectats amb lleixiu. Durant l’estada de la tortuga, cada dos dies, els tancs són rentats i es canvia l’aigua. Dues vegades a la setmana, les tortugues són alimentades amb petits peixos pelàgics.

Les mostres de femta recollides en vuit casos eren les primeres que havien fet els animals des de que eren en el centre. Aquestes mostres foren emmagatzemades a -20°C fins a l’extracció de l’ADN.

Per a l’extracció d’ADN, les mostres eren descongelades en un tampó salí amb Tris-Cl i EDTA durant 1 hora i a 70°C. Després d’afegir-hi lisozima, eren incubades a 37°C durant 1 hora, i s’hi afegia proteïnasa K i dodecilsulfat sòdic elevant la temperatura a 55°C. Després d’afegir-hi cloroform, es recuperava el sobrenedant, al qual s’afegia isopropanol. Això feia precipitar l’ADN, que era rentat amb etanol 70% i resuspès amb un tampó Tris-EDTA. La puresa i quantitat d’ADN era valorada espectrofotomètricament. Aquests extractes eren tramesos a Biodiversa srl., empresa radicada a Roveretto (província de Trento), on feien la seqüenciació de la regió V-3-V4 del gen ribosòmic 16 S.

Les seqüències obtingudes eren analitzades amb el sistema UPARSE que dissenyà en el 2013 Robert C. Edgar. Les unitats taxonòmiques operatives (OTU) eren definides d’acord amb un llindar d’identitat del 97%. El 71,24% de les lectures (un total de 725.157) passaren els filtres de qualitat. La identificació taxonòmica es realitzà amb la plataforma SILVAngs.

725.157 lectures d’alta qualitat a partir de nou mostres fecals

De les nou mostres s’obtingué un total de 1.017.914 lectures. Els filtres de qualitat (que foren representades amb més de 33 còpies i que tinguessin una longitud de 470 parells de nucleòtids) reduïren aquest nombre a 725.157. A través d’UPARSE, s’identificà un total de 1.423 unitats taxonòmiques operatives. Cada mostra contenia, de fet, entre 89 i 234 unitats operatives. Les 1.423 unitats representades en l’agregat de nou mostres es corresponien a 114 famílies, 62 ordres, 32 classes i 20 divisions.

Abundància relativa de diferents taxons entre les mostres sicilianes de Arizza et al. (2019) i les mostres toscanes i lígurs d’Abdelrhman et al. (2016), a nivell de divisió (a), classe (b), ordre (c) i família (d). En cada figura s’assenyalen únicament els 25 taxons més abundants

La diversitat bacteriana de les mostres va del 2,70 al 3,66 segons l’índex de Shannon-Wiener. El nombre de filotips oscil·lava entre 67 i 219.

La divisió bacteriana més abundant en les mostres fecals de la tortuga careta és la dels Firmicutes (els bacteris gram-positius clàssics), que assoleixen una abundància relativa del 49%. Hi segueix la divisió dels Bacteroidetes (21,5%), i ja més enrere van els proteobacteris (11%), els Epsilonbacteraeota (2%) i els fusobacteris (2%). Altres divisions presents, en poques quantitats i no en totes les mostres, eren Synergistetes, els actinobacteris, les espiroquetes, etc. En comparar les dades de Sicília amb les obtingudes per Abdelrhman et al. a la Ligúria-Toscana, cal dir que aquestes mostren una major presència de proteobacteris.

La família bacteriana més ben representada és la de les ruminococàcies (24%), seguida per les rikenel·làcies (10%), les lachnospiràcies (9%) i el grup vadinBB60 de clostridials (6%). També en aquest cas es constata una diferència entre les mostres sicilianes i les mostres toscanes.

La mostra S5 és la que difereix més en una anàlisi de components principals. Aquesta mostra era l’única que les nou analitzades que pertanyia a un animal que feia més de 10 setmanes que era al Centre de Recuperació. El període d’hospitalització, doncs, s’associa a un canvi en el perfil taxonòmic de la microbiota intestinal.

El perfil taxonòmic de les mostres fecals assenyala la presència en totes elles de bacteris predominantment anaeròbics i mesofílics, cosa lògica si pensem en la baixa tensió d’oxigen del tub intestinal de les tortugues, i en les temperatures moderades pròpies d’un organisme poiquiloterm marí. Totes les mostres presenten exemples de bacteris autotròfics i de bacteris heterotròfics. Gairebé totes les mostres contenen exemples de bacteris capaços de degradar cel·lulosa, quitina o xilè, o de reduir nitrit, o de fixar nitrogen. En quatre mostres hi ha bacteris capaços de metabolitzar l’atrazina (un dels herbicides més utilitzats). En cinc mostres hi ha bacteris capaços de reduir el selenat (component de diversos pesticides). En tres mostres hi ha bacteris capaços de degradar hidrocarburs aromàtics.

La microbiota intestinal de Caretta caretta

Les nou mostres analitzades per Arizza et al. se sumen a un llistat certament magre d’estudis metagenòmics de la microbiota fecal o cloacal de la tortuga careta. Les divisions bacterianes que constitueixen el nucli d’aquesta microbiota són les dels firmicutes, dels bacteroidetes i dels proteobacteris.

Els firmicutes, de fet, són la majoria dels bacteris d’aquestes microbiotes, arribant a gairebé la meitat dels genomes presents. La presència de firmicutes en la microbiota de rèptils s’associa a una dieta herbívora. De fet, això va en favor dels estudis que pensen que la tortuga careta, si bé essencialment carnívora (crustacis bèntics, eriçons de mar, gasteròpodes), també inclou en la seva dieta algues i detritus d’origen vegetal (inclosa fusta). És simptomàtic que Arizza et al. hagin detectat genomes bacterians en la femta d’aquestes tortugues amb capacitat de degradar matèria vegetal (quitina, xilà, lignina, etc.).

Arizza et al. no gosen aventurar-se gaire en la interpretació dels possibles signes de disbiosi en aquestes tortugues varades. Sí que comenten la sorpresa que els produeix que s’hi detectin en aquestes microbiotes grups de bacteris amb la capacitat de metabolitzar pesticides com l’atrazina o el selenat de sodi. L’atrazina fou prohibida a la Unió Europea en el 2004, però encara hi ha prou quantitat ambiental com perquè la selecció natural mantingui l’existència de bacteris capaços de degradar-la. Un altre signe indirecte de contaminants, és la presència en les nou mostres analitzades de bacteris capaços d’oxidar l’amoníac o deshalogenar compostos orgànics. Aquests bacteris poden arribar a les tortugues a través d’aliments, sediments o aigua contaminada.

Arizza et al., però, són conscients que es troben tan sols en el principi d’aquesta línia de recerca. El 8% dels bacteris detectats no han estat identificats taxonòmicament. A més, caldrà augmentar la base de dades amb mostres més diverses per poder determinar quins bacteris són pobladors habituals de la microbiota intestinal de la tortuga careta i quins són més transitoris. L’objectiu és trobar índexs de disbiosi que puguin ajudar al procés de recuperació d’aquestes tortugues.

Lligams:

New insights into the gut microbiome in loggerhead sea turtles Caretta caretta stranded on the Mediterranean coast. Vincenzo Arizza, Luca Vecchioni, Santo Caracappa, Giulia Sciurba, Flavia Berlinghieri, Antonino Gentile, Maria Flaminia Persichetti, Marco Arculeo, Rosa Alduina .PLoS One 14:e0220329 (2019).

 

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: