El marciment de la cigronera causat pel fong Fusarium oxysporum f. sp. ciceris constitueix una de les malalties més costoses des d’un punt de mira econòmic per al cultiu del cigró. A la Conca Mediterrània la raça 5 de F. oxysporum és la més estesa. No totes les variants de cigrons són igualment susceptibles a aquesta raça de fong. La base genètica de la resistència del cigró a aquest fong es trobaria en una regió de 820 kb del cromosoma 2. Un grup d’investigadors cordovesos, encapçalat per l’enginyera agrònoma Patricia Castro López, ha investigat aquesta regió genòmica, amb un estudi transcriptòmic de dues línies gairebé isogèniques de cigró, una de resistent i una altra de susceptible. En el seu estudi inclogueren 22 gens d’aquesta regió. Els resultats d’aquesta recerca apareixen ara en forma d’article a la revista PLoS One. El monitoratge dels canvis transcripcionals en les cigroneres després de la inoculació del fong, mostren l’existència d’un cúmul de 12 gens que s’indueixen a les 24 hores en les cigroneres resistents. En les cigroneres susceptibles, en canvi, hi ha un cúmul de 9 gens que s’indueixen a les 48 hores de la inoculació.
Cristina Caballo et al. han emprat dues línies de cigroneres, la RIP8-94-5 i la RIP8-94-11. En la imatge ens mostren la tija de les dues variants sis setmanes després de la inoculació amb la raça 5 de “Fusarium oxysporum” f. sp. “ciceris”. Mentre la RIP8-94-5 (A) no mostra signes de lesió, la RIP8-94-11 mostra la lesió típica que condueix al marciment de la planta.
L’expressió de 22 gens del cigró durant la infecció amb F. oxysporum
Aquesta recerca fou concebuda per Cristina Caballo Linares, Patricia Castro, Juan Gil, Teresa Millan, Josefa Rubio i Jose V. Die. Caballo i Rubio són investigadores del Área de Genómica y Biotecnología del Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA), a Alameda del Obispo (Córdoba). Castro, Gil, Millán i Die són membres del Departament de Genètica de la Escuela Técnica Superior de Ingenería Agronómica y de Montes (ETSIAM) de la Universidad de Córdoba.
En el disseny metodològic participaren Caballo, Castro, Rubio i Die. La investigació la conduí Caballo. En l’anàlisi formal intervingueren Caballo, Castro i Die.
La recerca fou finançada amb el projecte RTA2017-00041 del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) d’integració d’eines genòmiques i bioinformàtiques per a la millora de lleguminoses tradicionals, en el marc del ERDF2014-2020. Caballo i Die reben ajuts del Plan Propio de Investigación de la Universidad de Córdoba. La supervisió del projecte fou a càrrec de Gil, Millan, Rubio i Die.
El primer esborrany de l’article fou redactat per Caballo, i revisat pels altres autors. El 20 de març del 2019 fou tramès a la revista PLoS One, que confià l’edició a Vijai Gupta, de la Universitat de Tecnologia de Tallinn. El 8 d’octubre, l’article fou admès i es publicà el dia 23.
Després de la soja, el cigró o ciuró (Cicer arietinum L.) és el llegum més cultivat del món, amb una superfície de 145.000 km2 i una producció anual de 14,8 milions de tones. La major part de la producció es destina al consum humà, i és una de les fonts de proteïna de la dieta mediterrània tradicional. Entre les principals amenaces biològiques al cultiu del cigró hi ha les malalties causades per fongs i, molt especialment, per Fusarium oxysporum f. sp. ciceris que indueix el marciment de les cigroneres.
Fusarium ciceris és un fong ascomicet filamentós que viu normalment com a sapròfit en sòls. Infesta la cigronera a través de les arrels, quan el tub germinal del fong penetra les cèl·lules epidèrmiques de la planta. Les hifes s’estenen després a la regió cortical de l’arrel, i d’allà passen al xilema. El blocatge dels vasos xilemàtics (els qui condueixen “la saba bruta”) és la causa del marciment eventual de la cigronera. Fins i tot sense arribar al marciment, el fong pot condueix a una reducció del rendiment del cultiu.
No totes les variants de cigroneres són susceptibles a marcir-se per la infecció de F. ciceris. De fet, F. ciceris tan sols és patogènic per al gènere Cicer. Encara que pot penetrar en les arrels d’altres llegums (Vicia faba, Lens culinaris, Pisum sativum, Cajanus cajans), no provoca símptomes externs.
A través de l’estudi de la fisiologia del fong F. ciceris s’han identificat vuit races: 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 i 6. La raça 5 és la més important a la zona mediterrània. Diverses variants de cigroneres poden ésser resistents a una o més d’aquestes races. La resistència de vegades la confereix un únic gen, i d’altres diversos gens. En el cas de la raça 5, la resistència seria deguda a un únic gen localitzat en la regió LG2 del genoma de la cigronera. En aquesta regió LG2 també trobem gens que confereixen resistència a altres races de F. ciceris (0, 1, 2, 3, 4). El marcador genètic més estretament associat a aquest grup de gens és el microsatèl·lit TA59, que ha estat utilitzat en la selecció de variants de cigroneres resistents a F. ciceris.
Caballo et al. defensen la necessitat d’aprofundir en el coneixement d’aquesta regió genòmica. D’una banda, si se la coneix millor, hom podrà descriure altres marcadors que ajudin en els processos de selecció. D’altra banda, les dades genètiques poden il·luminar els mecanismes moleculars de la resistència al marciment per fongs.
El grup de Caballo en estudis previs ha aconseguit de delimitar la regió cromosòmica on es trobaria el gen de la resistència a la raça 5 a un segment de 820 kb del cromosoma 2.
En aquesta recerca, Caballo et al. utilitzen un parell de línies de cigroneres que són gairebé isogèniques: RIP8-94-5, que és resistent a la raça de F. ciceris, i RIP8-94-11, que és susceptible. Aquestes línies s’han obtingut mitjançant autofecundacions a partir d’un creuament de les variants ILC3279 (una cigronera kabuli susceptible a la raça 5) i WR315 (una cigronera desi resistent a totes les races de F. ciceris. Com a control fan servir Cr5-9, una variant derivada de C. reticulatum (PI489777) que és susceptible a totes les races de F. ciceris.
En aquests experiments, se sembren cigrons en safates plenes de perlita. Les safates són mantingudes a 22-25°C, amb una alternança de 12 hores de llum fluorescent i 12 hores de foscor.
Pel que fa al fong, l’adquireixen en forma de paper de filtre carregat amb espores del grup de W. Chen de la Washington State University. El paper de filtre és afegit a un medi de brou de patata amb dextrosa, i incubat a 25°C en moviment. Els cultius són després filtrats sota cotó per retirar-hi el miceli, i la part líquida és després centrifugada perquè s’hi formi un precipitat d’espores. El precipitat és resuspès perquè hi hagi una concentració d’un milió d’espores per mL.
Les plantes són inoculades amb la suspensió d’espores quan han arribat a l’estadi de tercer o quart node. Després de la inoculació les plantes són regades diàriament i reben una solució nutrícia cada setmana. Es prenen mostres de les arrels a les 24, 48 i 72 hores després de la inoculació. Aquestes mostres són immediatament congelades en nitrogen líquid i conservades a -80°C.
Les mostres d’arrels foren després descongelades per fer-hi una extracció d’ARN. Com a criteri de qualitat de l’ARN extret es fixà una ratio d’absorbància d’ultraviolat d’A260/A280 de 1,9-2,1 i de A260/A230 superior a 2,0. Alhora els extractes d’ARN eren tractat amb DNasaI per eliminar la presència residual d’ADN genòmic. Les mostres d’ARN total eren seguidament retrotranscrites per obtindre’n l’ADN complementari. Per descartar la presència d’ADN genòmic, es feia una PCR diferencial que havia de donar una banda de 180 parells de nucleòtids en el cas de l’ADNc i de 555 en el cas de l’ADNg. Una altra PCR servia per comprovar la integritat de l’ADNc.
Tan sols les preparacions d’ADNc que passaven aquests controls de qualitat entraven en la fase de PCR quantitativa (qPCR). Es feien qPCR per a 22 gens diferents, 19 dels quals eren situats entre els marcadors TA59 i CaGM07922, i 3 eren situats en altres regions del genoma.
Com a qPCR controls s’utilitzaren les del gen de la fosfatasa 2A (PP2A), de la proteïna PPR, del factor de transcripció TFIIA i de la seqüència Ca4g26410. Aquests gens de referència es caracteritzen per ésser expressats de manera estable i generalitzada en les cèl·lules de cigronera.
Dos grups de gens
Les cigroneres susceptibles a la raça 5 de F. ciceris, dues setmanes després de la inoculació comencen a desenvolupar una coloració groga generalitzada. A les cinc o sis setmanes de la inoculació, les plantes s’han marcit completament. Les cigroneres resistents, en canvi, malgrat la inoculació, mostren un creixement normal i saludable. Mentre les cigroneres afectades pel marciment mostren un sistema radical amb necrosi, les cigroneres resistents mostren un desenvolupament lateral del sistema radical. Quan hom observa talls de les tiges de les cigroneres susceptibles, és patent la colonització del xilema, mentre que en les cigroneres resistents no apareix aquest símptoma.
En analitzar les dades de qPCR, Caballo et al. distingeixen entre la “regulació dependent de tractament” (és a dir la diferència entre plantes inoculades i no-inoculades) i la “regulació dependent de genotip” (és a dir la diferència entre plantes resistents i plantes susceptibles).
En la regulació dependent de tractament, els 22 gens estudiats es poden dividir en dos grans grups. En el primer grup hi trobem 12 gens, que mostren una inducció en les plantes de genotip resistent a les 24 hores de la inoculació. En les plantes de genotip susceptible, aquests 12 gens també experimenten una inducció, però únicament a les 72 hores de la inoculació. Les proteïnes d’aquests 12 gens semblen associar-se a les membranes biològiques, bé com a proteïnes integrals de membrana o bé associades a activitats de transducció de senyals.
En el segon grup hi ha 9 gens, que mostren una inducció en les plantes de genotip susceptible a les 48 hores de la inoculació. Les proteïnes d’aquests gens semblen associar-se al nucli cel·lular i a la regulació de la transcripció gènica.
En la regulació dependent de genotip, dels 22 gens estudiats n’hi ha que són més expressats en la variant resistent RIP8-94-5, sobretot a les 24 hores de la inoculació. Altres gens són més expressats en la variant susceptible RIP8-94-11, sobretot a les 48 hores de la inoculació. Semblaria, doncs, que una part de la resistència consistiria en un reconeixement primerenc del patògen.
Dels gens analitzats, doncs:
– LOC101509359 és un gen amb una forta expressió diferencial entre les plantes resistents i les plantes susceptibles. La major divergència d’expressió entre unes i altres es produeix a les 24 hores de la inoculació, quan aquest gen és expressat més fortament en les plantes resistents. El gen LOC101509359 seria un factor de transcripció de tipus MADS-box. És la primera vegada que aquest gen es vincula a la resistència al fong Fusarium.
– LOC101499873 és un gen amb una forta expressió diferencial entre les plantes resistents i les plantes susceptibles. La major divergència d’expressió entre unes i altres es produeix a les 24 hores de la inoculació. El gen LOC101499873 codifica una proteïna homòloga a una proteïna de resistència del virus del mosaic del tabac.
– LOC101495941. És un gen que s’expressa més fortament en les cigroneres resistents que en les susceptibles. Codifica per a una proteïna de la família MATE, implicada en l’extrusió de compostos tòxics. És la primera vegada que aquest gen s’associa a la resistència a Fusarium.
– LOC101510206. És un gen que s’expressa més fortament en les cigroneres resistents que en les susceptibles. Codifica per a una serin-hidroximetiltransferasa, enzim implicat en el metabolisme d’aminoàcids. És la primera vegada que aquest gen s’associa a la resistència a Fusarium.
– LOC101490851. És un gen del cromosoma 7 que s’expressa més en les plantes resistents que no pas en les susceptibles a les 24 hores de la inoculació. Codifica per una xaperonina.
– LOC101503802. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101505941. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101506693. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101507659. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101509037. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101510206. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101510544. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101501552. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles.
– LOC101502928. És un gen que s’expressa més en les plantes susceptibles. Codifica per a un factor de transcripció de tipus WRKY, probablement implicat en la moderació de les vies de senyalització dels sistemes de defensa.
Fa dues dècades que aquest grup de recerca de Còrdova treballa en la susceptibilitat de les cigroneres al fong Fusarium. L’estudi de la susceptibilitat a la raça 5 de F. ciceris és especialment rellevant si tenim en compte la difusió d’aquesta en els cultius de l’àrea mediterrània. La comparació entre les variants RIP8-94-11 i RIP8-94-5 pel que fa als 22 gens seleccionats per Caballo et al. mostren no tan sols diferències d’expressió sinó també diferències en la temporalitat d’aquesta expressió respecte del moment de la inoculació. La variant susceptible RIP8-94-11 podria ser-ho pel fet d’activar de manera tardana un mecanisme de defensa, que sí s’activa a temps en el cas de RIP8-94-5. Així doncs, sembla que les primeres 72 hores posteriors a la inoculació són cabdals per decidir si la infecció pel fong progressa fins a produir marciment. Caballo et al. posen l’accent en tres gens de resistència: LOC101509359, LOC101495941 i LOC101510206. Amb aquestes dades a la mà, confien que una seqüenciació d’aquesta regió del cromosoma 2 en aquestes dues variants de les cigroneres podria ajudar a entendre les bases genètiques de la diferència en susceptibilitat.
Lligams:
– Candidate genes expression profiling during wilting in chickpea caused by Fusarium oxysporum f. sp. ciceris race 5. Cristina Caballo, Patricia Castro, Juan Gil, Teresa Millan, Josefa Rubio, Jose V. Die. PLoS One 14: e0224212 (2019).
Des de la Mediterrània 