L’octubre del 2016, comentàvem una recerca de Clodoaldo Roldán et al. sobre la caracterització química dels pigments rojos i grocs de les pintures rupestres de la Cova del Parpalló. El grup d’investigació de Clodoaldo Roldán i Sonia Murcia-Mascarós publica ara a Scientific Reports un article pioner en l’aplicació de tècniques òmiques en l’estudi de l’art rupestre. En aquesta ocasió, estudien una de les localitats emblemàtiques de l’art rupestre llevantí: el Barranc de Valltorta (Maestrat). D’una banda, realitzen un estudi metagenòmic de les comunitats bacterianes que colonitzen la pàtina de les pintures rupestres. Aquestes comunitats bacterianes, on hi dominen els Firmicutes (els bacteris gram-positius), tenen un efecte protector sobre les pintures. D’altra banda, realitzen un estudi proteòmic, orientat a la identificació dels aglutinants orgànics que permeteren la fixació dels pigments a la roca. Cal recordar que les qüestions de la natura química dels pigments i dels aglutinants són encara molt obertes, i que avançar en aquest sentit pot ajudar a avançar en la datació de les pintures.
Imatges de les superfícies mostrejades per Roldán et al. en les cobertes septentrionals de La Saltadora
Proteòmica i metagenòmica per a l’art rupestre
Aquesta recerca fou concebuda pel físic Clodoaldo Roldán, l’arqueòmetra Sonia Murcia-Mascarós i l’arqueòloga Esther López-Montalvo. Roldán i Murcia-Mascarós pertanyen a l’Institut de Ciència dels Materials de la Universitat de València (ICMUV), amb seu a Paterna. López-Montalvo pertany a la UMR 5608 TRACES, unitat adscrita al CNRS i a la Universitat de Tolosa 2-Joan Jaurès.
En la realització del mostreig participaren, a més dels tres investigadors indicats, Manuel Porcar, de Darwin Bioprospecting Excellence, SL, empresa amb seu al Parc Científic de la Universitat de València a Paterna, i alhora membre de l’Institut de Biologia Integrativa de Sistemes. En l’anàlisi de dades, a més de Murcia-Mascarós, Roldán i Porcar, participà Cristina Vilanova, de Darwin Bioprospecting.
La investigació es finançà a càrrec del projecte NEOSOCWESTMED, dins del 7è Programa Marc de la Comissió Europea (2007-2013), i del Projet Émergent 2016 de TRACES. La Direcció General de Patrimoni Cultural de la Generalitat Valenciana atorgà els permisos per realitzar els mostrejos en les Coves de la Saltadora. Els investigadors comptaren amb el suport de Josep Casabó i els guies culturals del Museu de la Valltorta. En aquest sentit tenen un especial esment per al desaparegut Eugenio Barreda, guia de les pintures de Valltorta-Gassulla.
El primer redactat de l’article fou tramès a l’editora de Nature el 27 de juny del 2017. Seguí un llarg procés de revisió que no acabà fins el passat 11 de juny quan fou acceptat per a Scientific Reports, que el publicà el 3 de juliol.
En última instància el motiu de la recerca és contribuir a l’esclariment del marc crono-cultural de l’art rupestre llevantí. Ara com ara hi ha dues escoles en aquest sentit. Una proposa que l’art rupestre llevantí va lligat amb el procés de neolitització (VI-III mil·lennis a.C.). L’altra el suposa més antic, de temps mesolítics, assenyalant sobretot aspectes temàtics: les referències a la caça major en particular.
Àrea de distribució de l’art rupestre llevantí (b). El barranc de Valltorta (c), en el terme municipal de Tírig, és una localitat destacada, i en ell hi trobem les Coves de la Saltadora (requadre). Roldán et al. han investigat els abrics de la zona nord de la Saltadora.
En els darrers anys s’han fet notables avenços en la caracterització química dels pigments, a la qual han contribuït notablement el grup de Roldán i Murcia. Més desconeguda és la sèrie d’operacions tècniques associades a la pintura. Hom ha suposat en general que els pigments emprats eren solucions o suspensions simples, sense la incorporació d’ingredients aglutinants de natura proteica o lipídica. No obstant, la identificació de restes de cèl·lules vegetals en pigments negres de pintures llevantines ha fet pensar en l’ús de barreges complexes.
Roldán et al. justifiquen l’ús de tècniques metagenòmiques en la importància que té l’activitat microbiana en la preservació i degradació de pigments i aglutinants en les pintures rupestres. Àcids orgànics d’origen microbià, com l’àcid oxàlic, contribueixen a l’enfortiment de la pàtina. Contràriament, la solubilització microbiana de carbonats contribueix a la degradació progressiva de la pàtina.
La proteòmica es destina a la identificació de possibles aglutinants orgànics.
En aquesta recerca, se centren en els pigments rojos de les pintures dels abrics de la zona nord de les Coves de la Saltadora, al barranc de Valltorta. Aquestes pintures són especialment reconegudes per la diversitat de motius, estils i temes. Anàlisis prèvies del grup de Roldán indiquen la presència d’un pigment fèrric per sota d’una pàtina superficial càlcica.
Mostreig
En total es recolliren 11 mostres, totes elles de mida submilimètrica. El material era recollit per microbiòlegs amb un escalpel estèril sota la supervisió d’arqueòlegs. Tres mostres (CSI-01, CSV-01, CSV-02) provenien de motius figuratius de color roig. Dues mostres (CSI-04, CSV-03) provenien de zones sense pintar properes a aquest motius. Una mostra (CSVI-01) provenia d’una paret rogenca de l’abric. Tres mostres (CSI-02, CSI-03, CSVII-01) provenien de superfícies d’exposició recent degut al despreniment d’escates. Dues mostres (COL, CRU) foren recollides de pàtines naturals presents en roques situades fora de l’abric.
Alíquotes de les mostres eren sotmeses a una digestió amb lisozima i proteïnasa K, seguida d’un tractament amb el detergent SDS i un cicle de congelació-descongelació. Aquestes alíquotes serviren per a la purificació d’ADN en membranes de silica-gel.
L’extracte d’ADN fou sotmès a una amplificació de PCR amb primers dissenyats per acotar la regió hipervariable V3-V4 del gen de l’ARNr 16S. El producte d’amplificació fou seqüenciat en la plataforma Illumina MiSeq.
Altres alíquotes de les mostres foren destinades a l’aïllament i digestió de proteïnes. Les suspensions de pèptids resultants eren analitzades per cromatografia líquida i espectrometria de masses (LC-MS/MS).
Metagenomes
La massa de les mostres preses era prou petita, especialment en el cas de les àrees pintades, no arribant a 15-20 mg en alguns casos. Això explica que sols s’obtingués ADN metagenòmic en les mostres CSI-01, CSI-04, CSVI-01, COL i CRU. Les anàlisis proteòmiques funcionen millor amb aquesta poca quantitat de mostra, i així es pogueren aplicar a CSI-01, CSV-01, CSV-02, CSI-04, CSVI-01, CSI-02, CSI-03 i CSVII-01.
En les mostres CSI-01, CSI-04, CSVI-01, COL i CRU es detectaren de mitjana 200 unitats taxonòmiques operatives (OTU) per mostra. Les OTUs dominants pertanyien a la divisió dels firmicuts i concretament als gèneres Staphylococcus, Enterococcus i Thermicanus. En dos de cada tres mostres, els tres OTUs dominants suposaven el 30% de les lectures. Altres OTUs destacades pertanyien als gèneres Acinetobacter, Rubellimicrobium, Pseudomonas i a la família de les comamonadàcies.
En la mostra CSI-01, un àrea pigmentada, els genomes més presents eren d’Enterococcus, Thermicanus i Bacillus thermoamylovorans. Els perfils metagenòmics de les mostres no-pigmentades, CSI-04 i CSVI-01, no eren estatísticament diferents.
Les mostres associades pintures (pigmentades o no) mostraven això sí una diversitat bacteriana superior a la de les mostres de roca no associades. Així, en les mostres COL i CRU es detectaren sols unes 65 OTUs, amb un domini clar dels cianobacteris (formidiàcies i nostocàcies).
Proteomes
En les mostres pigmentades (CSI-01, CSV-01, CSV-02) es detectaren unes 100 proteïnes diferents. Les mostres no-pigmentades mostraven una diversitat proteica superior, arribant a les 500 proteïnes.
La majoria de proteïnes detectades eren queratines humanes, la qual cosa és un indicador d’un baix contingut proteic. En les mostres procedents de motius figuratius (CSI-01, CSV-01, CSV-02) s’hi detectaren albúmina bovina i proteïnes humanes S100. En la mostra CSV-02, addicionalment, s’hi detectà un ventall de proteïnes ribosomals bacterianes. En la mostra CSVI-01, corresponent a una pàtina rogenca, s’hi detectaren caseïna bovina i proteïnes humanes S100.
Roldán et al. paren atenció en la presència de dos pèptids, FFVAPFPEVFGK i YLGYLEQLLR, corresponents a fragments de l’alfa-S1-caseïna bovina. Així comparen l’abundància del pèptid YLGYLEQLLR amb l’abundància de dotze pèptids de queratines humanes. D’aquesta manera troben abundàncies relatives de caseïna bovina en les mostres pigmentades CSI-01 i CSV-01, en relació a les mostres control no-pigmentades. Ara bé, la pàtina rogenca CSVI-01, externa a les pintures, també resulta rica en caseïna bovina.
Mitjançant espectroscòpia Raman sobre les mostres CSV-01 i CSV-02, Roldán et al. identifiquen la presència d’hematite. En la pàtina que cobreix aquests motius rojos, s’hi detecten oxalats, carbonats càlcics i sulfats càlcics.
Llet de vaca com a aglutinant?
En estudis similars sobre l’art rupestre paleolític “franco-cantàbric” els bacteris més abundants en les pàtines són proteobacteris, acidobacteris i actinomicets. En les pàtines de l’art “llevantí”, per contra, els més abundants són els firmicuts. Potser això s’explica per l’eixutesa relativa del clima mediterrani. De fet, en les mostres preses fora de l’abric, amb una major humitat, hi abunden més els cianobacteris.
La relació Bacilli:Flavobacteria és elevada en les mostres de les Coves de la Saltadora. Això podria indicar una funció preservadora de la comunitat microbiana, ja que Bacillus contribueix a la protecció del pigment mitjançant la producció d’àcid oxàlic. Flavobacterium, en canvi promou el deteriorament de les pàtines d’oxalat.
La detecció de pèptids de caseïna bovina en les àrees pigmentades amb una abundància superior a les àrees no-pigmentades fa que Roldán et al. pensin en la possibilitat que en l’art llevantí es fes servir llet bovina com a agent aglutinant per als pigments rojos. La cria de ramats a la Península Ibèrica no comença fins el VI mil·lenni a.C., en el marc de l’anomenada “revolució neolítica”. Jaciments neolítics del Maestrat assenyalen la presència de ramats de Bos taurus, Capra hircus i Ovis aries pels volts dels 5400 a.C. En restes ceràmiques de la Cova de l’Or, a Beniarrès, hom ha identificat la presència de residus de llet de cabra.
Estudis d’arqueologia experimental ha mostrat la necessitat d’afegir greixos animals per donar als pigments prou consistència i adherència per pintar pedra calcària. Ocre roig en pols barrejat en llet líquida podria ésser el material emprat per fer el roig de les pintures llevantines.
La presència de matèria orgànica en els pigments llevantins obre la possibilitat d’emprar tècniques de datació basades en el radiocarboni.
Lligams:
– Proteomic and metagenomic insights into prehistoric Spanish Levantine Rock Art. Clodoaldo Roldán, Sonia Murcia-Mascarós, Esther López-Montalvo, Cristina Vilanova, Manuel Porcar. Scientific Reports 8: 10011 (2018).
Des de la Mediterrània 