L’edició genètica en la mosca mediterrània de la fruita (Entomologia mediterrània, 35/2018)

El passat mes d’abril comentàvem una recerca de Sciarretta et al. sobre la dinàmica espacio-temporal d’una població de mosca mediterrània de la fruita (Ceratitis capitata) en una plantació de presseguers. Aquesta investigació anava encarada a oferir claus en la gestió integrada d’aquesta espècie de la família dels tefrítids, que pot constituir una plaga en fruiters i hortes. El caràcter polifàgic i invasiu d’aquesta espècie la fa encara més preocupant. La gestió integrada de plagues vol reduir l’impacte de les tècniques convencionals d’ús de pesticides. Dins d’aquest marc, una de les estratègies emprades és l’anomenada “tècnica d’insecte estèril” (SIT, en l’acrònim anglès). La SIT consisteix en l’alliberament massiu d’insectes estèrils, reduint la capacitat reproductiva de la plaga. La SIT clàssica empra un mètode radiològic per induir l’esterilitat, i així s’ha utilitzat en programes a Mèxic, Florida i Califòrnia per impedir l’establiment de C. capitata en aquests territoris. Però no en totes les espècies, la irradiació és efectiva com a base de la SIT. Una alternativa la constitueixen les tècniques de modificació genètica, però la legislació de moltes circumscripcions és altament restrictiva contra l’alliberament al medi d’organismes genèticament modificats, encara que siguin estèrils. Aquesta legislació no sol afectar l’edició genòmica a través del sistema CRISPR-Cas. És per això que Roswitha A. Aumann, Marc F. Schetelig i Irina Häcker, de l’Institut de Biotecnologia d’Insectes de la Universitat Justus Liebig de Gießen, han assajat l’edició genètica en C. capitata. Han aconseguit per primera vegada aplicar l’edició genètica per reparació dirigida a l’homologia d’alta eficiència per CRISPR-Cas a una espècie de tefrítid. A través de la injecció de complexos ribonucleoproteics CRISPR-Cas9 emprant diferents ARN guies i un curt donador d’ADN monocatenari, han convertit un transgen per a una proteïna fluorescent verda en un per a una proteïna fluorescent. Aumann et al. ens ofereix en un article a la revista Insect Biochemistry and Molecular Biology dades sobre el mecanisme molecular de l’edició gènica en aquesta espècie de tefrítid. L’eficiència d’aquesta tècnica és prou interessant per a que sigui aplicada en protocols de mutacions que no es puguin seguir fenotípicament. Seria el cas de mutacions inductores de l’esterilitat, que podrien aplicar-se així doncs en la SIT de forma més profitosa que la mutagènesi clàssica. Aumann et al. són conscients que bona part d’aquestes perspectives depenen de si les alteracions per CRISPR seran o no considerades pel legislador com a modificacions genètiques, i de la regulació que se’n desprengui.

Aumann et al. han estat pioners en la introducció de l’edició gènica per CRISPR-Cas HDR en un tefrítid, concretament “Ceratitis capitata”. L’eficiència de la tècnica és elevada (fins a un 90%). Potencialment, doncs, es podria utilitzar per la creació de soques d’insectes per a tècniques de control de plagues sense veure’s afectat per la legislació sobre organismes modificats genèticament

L’edició gènica com a tècnica de mutagènesi dirigida

Roswitha A. Aumann va iniciar el mes de maig del 2017 el treball de tesi doctoral en el Departament d’Insektenbiotechnologie im Pflanzenshutz de l’Institut für Insektenbiotechnologie de la Justus-Liebig-Universität Giessen. Aumann, a més de l’optimització dels mètodes de Crispr/Cas per a insectes és interessada en l’avaluació de sistemes per a l’estabilització de transgènics, tot això encarat en el desenvolupament de noves estratègies per a un control menys contaminant de pestes agrícoles i de mosquits.

El director del Departament és el professor Marc F. Schetelig. Schetelig treballa en aspectes fonamentals de biologia de desenvolupament i, particularment, en el desenvolupament de sistemes integrats de control de plagues, amb l’ús de tècniques de transgènesi, d’edició genètica i d’impuls genètic.

Irina Häcker arribà al Departament de Biotecnologia d’Insectes per a la Protecció Vegetal el maig del 2013. Häcker lidera, juntament amb Schetelig, un Grup “Emmy Noether” d’avaluació de riscos d’insectes transgènics, adscrit a la Universitat de Gießen i que rep finançament de la Fundació Alemanya de Recerca.

Alhora, però, Aumann, Schetelig i Häcker són membres també del Departament de Plagues i Control Vectorial de la Divisió de Biorecursos de l’Institut Fraunhofer de Biologia Molecular i Ecologia Aplicada, també localitzat a Gießen. Amb finançament de la Societat Fraunhofer, Schetelig lidera un grup que treballa en el desenvolupament de noves tecnologies de control de plagues.

Aquesta recerca, de fet, rep finançament del LOEWE Zentrum für Insektenbiotechnologie & Bioressourcen, de Fraunhofer-IME i del Programa Emmy Noether de la Fundació Alemanya de Recerca.

Aumann realitzà aquesta recerca en el marc de la seva tesi doctoral, i del projecte de Schetelig i Häcker. En el disseny hi participaren Schetelig, Aumann i Häcker. Tots tres analitzaren les dades. Aumann, Häcker i Schetelig redactaren l’article. Tenen paraules d’agraïment pel suport tècnic a Tanja Rehling, Derya Arslan i Julia Hehner, així com a Kate Sutton per la revisió prèvia del text.

La tria de Ceratitis capitata com a espècie model no és casual. La mosca mediterrània de la fruita és un insecte polífag, que pot alimentar-se de més de 250 espècies de fruiters (fruita dolça, fruits secs) i de plantes d’horta. És poc exigent quant a l’hàbitat i tolera un ample rang de temperatures. És, a més, una espècie invasiva, la qual cosa l’eleva a la categoria d’una de les plagues més devastadores a escala mundial.

Aumann et al. són interessats en el desenvolupament de tècniques de control de plaga alternatives a l’ús d’insecticides. Entre aquestes tècniques hi ha la introducció d’insectes estèrils (SIT). Normalment, la SIT consisteix en alliberar dins d’una població d’insectes, mascles esterilitzats d’aquesta mateixa espècie. Això provoca un augment dels aparellaments infèrtils, i la reducció consegüent de la progènie. Hom esmenta la SIT en l’efectivitat per posar a ratlla la mosca mediterrània de la fruita a Florida o a Califòrnia en els anys 1990.

En SIT hom anomena “sexing” a la generació de poblacions exclusivament masculines. En el SIT s’utilitzen habitualment sols mascles estèrils perquè les femelles estèrils poden arribar a posar ous que, malgrat que no es desenvolupessin, podrien danyar de totes maneres la collita. Alguns SIT es basen en l’aprofitament de mutacions conegudes presents en les poblacions naturals o generades per mutagènesi clàssica (amb l’ús de radiacions ultraviolades, etc.). Però si hom vol aplicar el SIT a espècies de les quals no coneixem prou aquestes mutacions sembla més aconsellable l’ús de tecnologies d’ADN recombinant per tal d’introduir-hi transgens. Ara bé, això implica un SIT en el qual s’alliberin organismes modificats genèticament. En gairebé totes les jurisdiccions aquest alliberament es troba altament regulat, i en algunes directament prohibit.

Per exemple, a Europa s’apliquen les Directives 2001/18/EC i 90/220/EEC pel que fa a l’alliberament deliberat d’organismes modificats genèticament en el medi. La directiva demana que per a l’organisme en qüestió es faci una avaluació del risc ambiental, que siguin traçables, i que compleixin les normatives d’etiquetatge i de monitorització. El Tribunal de Justícia de la UE ha interpretat que aquesta directiva inclou únicament aquells organismes que han incorporat gens (trangens). Així doncs, les tècniques de mutagènesi dirigida hi queden excloses, ja que no impliquen la introducció de material genètic.

Si la mutagènesi clàssica (per irradiació o per exposició a substàncies químiques mutàgenes) té un caràcter aleatori, la mutagènesi dirigida s’adreça específicament a la introducció d’un canvi. Les sigles CRISPR volen dir “repeticions palindròmiques breus interespaiades regularment en agregats”. Descobertes per Francisco Mojica en arqueons (Haloferax, Haloarcula), el sistema CRISPR actua com una defensa antiviral en organismes procariòtics, a través de la proteïna Cas (associada a CRISPR).

El sistema CRISPR-Cas en la defensa antivírica d’un bacteri

El sistema CRISPR-Cas pot ésser utilitzat en la mutagènesi dirigida de dues maneres:
– per la via d’unions no-homòlogues (NHEJ). Introdueix en el lloc seleccionat insercions o delecions no-definides.
– per la via de reparació dirigida per homologia (HDR). Fa una edició del lloc seleccionat de manera definida.

El sistema CRISPR-Cas HDR és, doncs, un sistema d’edició gènica, que permet la introducció de canvis específics de seqüència sense deixar seqüències exògenes en el genoma. Així doncs, és una alternativa a la mutagènesi clàssica sense haver de caure en la transgènesi.

Per assolir l’edició gènica, cal ajustar la tècnica CRISPR-Cas de manera que es promogui la via HDR en detriment de la via NHEJ. Aquest ajustament però depèn de condicions que no tan sols varien d’una espècie a l’altra sinó que, dins d’una mateixa espècie, difereixen segons el tipus cel·lular, i dins del mateix tipus cel·lular, poden diferir segons el moment del cicle cel·lular. L’ajustament requereix la inhibició dels enzims que participen en la via NHEJ (com utilitzar l’inhibidor Scr7 front l’activitat ADN ligasa IV) i el control constant dels nivells de Cas9. Fins i tot si hom ha promogut la via HDR, cal previndre que això comporti reedicions.

Per a fixar les condicions de CRISPR-Cas HDR se sol utilitzar un sistema basat en l’eGFP (proteïna fluorescent verda), enfocat a convertir-la en BFP (proteïna fluorescent blava). Aquesta conversió s’aconsegueix mitjançant la substitució de dues bases nucleotídiques del gen eGFP. Si l’HDR ha funcionat la fluorescència serà blava; si la fluorescència és verda, vol dir que no s’ha produït mutació; si la fluorescència es perd, vol dir que la NHEJ ha destruït la funcionalitat del gen.

L’objectiu d’Aumann et al. era aconseguir una via CRISPR-Cas HDR d’alta eficiència emprant el sistema eGFP, combinat amb un oligodesoxinucleòtic de cadena senzilla (ssODN) com a motllo de reparació. Així doncs, injectaven in vitro complexos ja ensamblats de ribonucleoproteïna Cas9-gRNA, alhora que el donador ssODN, a embrions de C. capitata transgènics per a eGFP.

Les mosques

La línia de mosques transgèniques que utilitzen Aumann et al. en aquest experiment és Ceratitis capitata TREhs43Ala5_F1m2, que són portadores d’un gen eGFP amb el promotor de la poliubiqüitina de Drosophila melanogaster, de tal manera que expressen una fluorescència verda en el cap, el tòrax i les potes quan són adultes. Com a línia de mosques control fan ús de la Ceratitis capitata Egypt-II. Unes i altres eren mantingudes a 26ºC, a 48% d’humitat relativa i amb un cicle de llum foscor de caràcter estival (14:10). A les mosques adultes se les alimentava amb la barreja habitual de sucre i extracte de llevat, i amb accés a aigua. A les larves se les feia créixer en un gel alimentari amb pols de pastanaga, agar, extracte de llevat, àcid benzoic, HCl i etil-4-hidroxibenzoat. Abans de qualsevol procediment, les mosques eren anestesiades amb CO2.

Els reactius CRISPR-Cas9

La proteïna Cas9 purificada és un reactiu comercial (Aumann et al. l’adquireixen a PNA Bio Inc.).

Els motllos d’ADN bicatenari lineal per a gRNAs específics els produïren en el laboratori per PCR. Els sintetitzaren d’acord amb la seqüència del gen eGFP. Havien d’incorporar també una seqüència d’interacció amb Cas9.

El motllo portador d’informació de la BFP era un ADN monocatenari linial de 140 nucleòtids. La seqüència només difereix de l’eGFP en tres nucleòtids: 194C>G, 196T>C i 201 C>G. El canvi en 201 és un canvi silent. El canvi 194 produeix un canvi en la seqüència proteica Thr65>Ser65, que torna l’eGFP en GFP (tal com apareixia en el gen originari de la medusa Aequorea victoria). El canvi 196 produeix en la seqüència proteica el canvi Tyr66>His66 que canvia la fluorescència de verda a blava.

La tècnica de microinjecció

La barreja d’injecció conté 360 ng/μL de proteïna Cas9, 200 ng/μl de gRNA_eGFP i 200 ng/μl de ssODN_BFP, amb una concentració de KCl de 300 mM i una de Scr7 de 1 mM. Cada preparat tenia un volum de 10 μl; es preparaven en fresc, i se’ls deixava durant 10 minuts a 37ºC perquè es produí el preensamblatge de gRNA-Cas9.

Els ous de mosca eren decorionitzats químicament amb hipoclorit sòdic. Després els fixaven en un portaobjectes, i es cobrien amb oli d’halocarboni 700.

Per a les injeccions utilitzaven agulles de borosilicat. L’estació d’injecció consisteix en un macromanipulador manual, un microjector i un microscopi. Després de la injecció, els portaobjectes eren mantinguts a 25ºC amb 60% d’humitat durant 72 h en una cambra d’oxigen, per tal que les larves eclosionessin. Era llavors quan les basaven de l’oli a l’esmentat medi larval.

Els embrions injectats donaven lloc, doncs, a larves, i les larves a adults. Tots els adults procedents d’embrions injectats (generació 0, G0) eren creuats amb tres mosques verges de sexe contrari EgII. D’aquests creuaments, hom recollia els ous (generació 1, G1). De les mosques G0 i G1 s’examinava la fluorescència eGPF, i de les G1 també la BFP. Per fer-ho utilitzaven un estereomicroscopi amb filtres d’epifluorescència.

D’algunes mosques G1 es va fer una extracció d’ADN genòmic. Aquest ADN era sotmès a una amplificació de la regió corresponents a les dianes gRNA. Hom verificava l’aparició de mutacions no-previstes.

La selecció dels ARN guies i els experiments d’injecció

El gRNA o ARN guies són els que marquen la seqüència diana sobre la qual volem que operi el sistema Cas9-CRISPR. Aumann et al. en aquests experiments utilitzaren dos guies, eGFP_gRNA2 i eGFP_gRNA2b.

En 243 embrions, s’injectà eGFP_gRNA2 amb Cas9 i ssODN_BFP. D’aquests 243 embrions 16 arribaren a la fase larval, i 8 (3 mascles i 5 femelles) arribaren a la fase adulta. D’aquests vuit adults, tan sols tres (M1, F2 i F8) donaren lloc a creuaments fèrtils. I d’aquests tres creuaments fèrtils. De M1 es recolliren 116 mosques G1, de les quals 98 eren sense fluorescència. De F8 es recolliren 42 mosques, de les quals 34 eren sense fluorescència. En cap d’aquestes mosques G1 no s’observà fluorescència blava. Cal pensar que l’absència de fluorescència en tantes mosques G1 es deu a la disrupció del gen eGFP pel sistema CRISPR.

En 323 embrions, s’injectà eGFP_gRNA2 amb 1 mM de Scr7. D’aquests 323 embrions, 79 arribaren a l’estat larvari i 31 (17 mascles i 14 femelels) a l’edat adulta. D’aquestes 31 mosques G0 hi hagué 27 creuaments fèrtils. En total, s’examinaren 1967 mosques G1, i totes elles mostraren una fluorescència verda.

En 371 embrions, s’injectà eGFP_gRNA2-Cas9 amb ssODN_BFP. D’aquests 371 embrions, 19 arribaren a l’estat larvari i 9 (5 mascles i 4 femelles) a l’edat adulta. Dels nou creuaments, foren fèrtils quatre (M3, M5, F1 i F4). De les mosques G1 la majoria (79%-100%, segons la família) ja no mostrava fluorescència.

La verificació molecular de l’HDR

De gairebé totes les mosques G1 que no mostraven fluorescència s’obtingué el genotip.

En l’experiment de la injecció eGFP_gRNA2 es genotiparen 94 mosques G1 de la família M1. D’aquestes 94 mosques, n’hi havia 18 que havien incorporada la substitució completa (3 mutacions). Unes altres 50 portaven una substitució més curta (2 mutacions). Les altres 26 mosques havien experimentat insercions o delecions (atribuïbles a NHEJ).

D’aquest mateix experiment eGFP_gRNA2 es genotiparen 32 mosques G1 de la família F8. Disset havien incorporat les 3 mutacions previstes, mentre 9 tan sols n’havien incorporat 2. En 6 mosques s’observaren delecions (atribuïbles a NHEJ).

Aumann et al. recolliren els ous corresponents a G1 en tres tongades (T1, T2 i T3). És interessant veure que els casos d’HDR augmenten amb el temps. En la família M1, per exemple, l’HDR és efectiu en l’11,5% de T1 i en 37% de T3. En la família F8, hom passa d’un HDR efectiu en 28,5% dels casos en T1 a 100% en T3.

És l’experiment amb eGFP_gRNA2b el que mostra un HDR més eficient. En les quatre famílies analitzades, el valor HDR va del 70% al 96%. Els nivells de NHEJ són baixos. El valor HDR és superior en els ous recollits més tardanament (T3).

L’edició genòmica en la mosca mediterrània de la fruita

Aumann et al. han aconseguit desenvolupar una tècnica d’edició genètica en Ceratitis capitata mitjançant CRISPR-Cas HDR. És cert que el gen diana és un transgen eGFP. També cal dir, que tan sols el 50% dels adults procedents d’embrions injectats són fèrtils. Val a dir, però, que dels adults fèrtils, la freqüència d’edició sí és elevada.

Resulta curiós que, malgrat l’alta eficiència aconseguida en l’edició no hagin pogut detectar la transformació de l’eGFP a un BFP. En efecte, en cap dels individus no han pogut observar una fluorescència blava. Aumann et al. pensen que això pot ser degut a l’excessiva mentalització del tòrax d’aquests espècie, o que potser hi ha una autofluorescència que se superposa al filtre utilitzat en el detector.

En alguns casos, l’HDR és incomplet, i per comptes de les tres mutacions previstes, tan sols apareixen dues. Aquest fenomen pot indicar la limitació de la tècnica quan es vol editar un fragment considerable d’ADN, però Aumann et al. pensen més aviat que això es deu a una reedició.

Les xifres millors d’HDR s’aconsegueixen en ous tardans, és a dir d’ous procedents d’individus G0 de major edat.

Pel que fa a Scr7, Aumann et al. no han trobat que augmenti la via HDR, com sí ho fa en cultius cel·lulars humans o en embrions de ratolí. Però sí que troben que l’addició de Scr7 augmenta la supervivència dels ous injectats fins a l’estat larvari (del 5% al 25%).

La regulació dels organismes modificats per CRISPR-Cas és a la base d’aquesta recerca de Aumann et al. En els Estats Units, el Departament d’Agricutlura considera que els organismes editats per CRISPR no són regulats per les normatives sobre transgènics, fins i tot quan això es fa a través de la via NHEJ. A la Unió Europea, la clau serà resoldre si l’edició CRISPR-Cas entra dins del concepte de “tècniques de mutagènesi”, les quals són excloses de la regulació sobre organismes modificats genèticament. La via HDR és més probable d’ésser acceptada que no pas la via NHEJ.

Aumann et al. consideren que aquesta recerca pot ajudar a pensar en aplicar la tècnica d’edició gènica CRISPR-Cas en altres tefrítids, com Bactrocera dorsalis, B. olea, Anastrepha ludens o A. suspensa. El primer pas seria començar a pensar en protocols per a la generació de mascles estèrils de C. capitata i d’aquestes altres espècies.

Lligams:

Highly efficient genome editing by homology-directed repair using Cas9 protein in Ceratitis capitata. Roswitha A. Aumann, Marc F. Schetelig, Irina Häcker. Insect Biochem. Mol. Biol. S0965-1748(18)30222-4 (2018).

Arxivat a Ciència i Tecnologia
%d bloggers like this: