Testimoni de la base comuna compartida pel sistema immunitari de les diferents divisions del Regne Animal és que el test que es fa per a la detecció i quantificació d’endotoxines bacterianes es basi en la resposta d’un extracte amebòcits del límul, un artròpode, o bé del factor coagulant C extret dels grànuls d’aquests amebòcits. L’endotoxina bacteriana per excel·lència és el lipopolisacàrid (LPS) que integra la membrana externa dels bacteris gramnegatius. El sistema immunitari dels més diversos animals té la capacitat de detectar la presència d’aquest LPS i de desencadenar una resposta immunitària (febre, etc.) encaminada a combatre aquesta presència bacteriana. Hom anomena al LPS endotoxina perquè aquesta resposta immunitària pot arribar a descontrolar-se en un xoc sèptic. Per això el test del límul és necessari per garantir que una solució estèril sigui, també, apirètica. La resposta al LPS fa part d’allò que anomenem “sistema immunitari innat” o “sistema immunitari inespecífic”, en el sentit que és una resposta estesa a tots els bacteris gramnegatius. En vertebrats trobem un “sistema immunitari adaptatiu” o “específic”, que disposa d’elements més sofisticats (anticossos, etc.). La immunologia comparada, però, encara té moltes qüestions pendents en molts grups d’invertebrats. És el cas dels equinoderms en general, i dels eriçons de mar o garotes en particular. Ens equivocaríem si penséssim que el seu sistema immunitari és primitiu o simple. En el cas de la garota Paracentrotus lividus se sap que un tipus cel·lular, el celomòcit manté a ratlla amenaces microbianes a través de la fagocitosi, l’encapsulació de partícules estranyes i la producció de factors antimicrobians. El grup de Vita di Stefano del Departament de Ciències i Tecnologies Biològiques, Químiques i Farmacèutiques de la Universitat de Palerm, ha investigat detalls d’aquesta resposta immunitària a través d’un model d’injecció de LPS en la cavitat corporal o celòmica d’aquesta garota mediterrània. En un article a PLoS One expliquen com recollien celomòcits a diferents temps (1 h, 3 h, 6 h i 24 h) després de la injecció per tal d’estudiar-hi el proteoma (el conjunt de proteïnes) mitjançant una tècnica quantitativa d’espectrometria de masses sense marcatge. D’aquesta manera segueixen la modulació del proteoma produïda per la injecció de LPS, i com es relaciona amb la resposta immunitària cel·lular (endocitosi, fagocitosi, etc.). En la resposta al LPS, el celomòcit reorganitza el seu citoesquelet i adapta el seu metabolisme energètic. Alhora, hi ha una producció de proteïnes de resposta a l’estrès (Hsp, histones, etc.). Els detalls dels canvis proteòmics s’han publicat a la base de dades ProteomexChange.
Paracentrotus lividus
Una recerca immunoproteòmica
Aquesta investigació fou concebuda per Luigi Inguglia, Marco Chiaramonte, Vincenzo Arizza i Vita Di Stefano. Tots ells són membres del Dipartimentu STEBICEF de l’Univirsitati di Palieimmu, i alguns els hem vist en altres ocasions en les seves recerques sobre l’aplicació de tècniques òmiques en qüestions de biologia marina.
En aquesta investigació comptaren amb la col·laboració de Turiák Lilla, Vékey Károly i Drahos László del Grup de Recerca de Proteòmica d’Espectrometria de Masses de la Magyar tudósok körútja, a Budapest.
La metodologia fou a càrrec d’Inguglia, Chiaramonte, Arizza, Turiák, Vékey, Drahos i Di Stefano. Inguglia i Chiaramonte obtingueren i analitzaren les dades. Turiák aportà el programari. En la investigació participaren Inguglia, Chiaramonte, Turiák, Vékey, Drahos, Rosa Pitonzo (STEBICEF) i Di Stefano. La validació la feren Inguglia, Chiaramonte, Arizza, Drahos, Pitonzo, Giuseppe Avellone (STEBICEF) i Di Stefano. Vékey realitzà els gràfics.
La recerca es finançà amb el projecte de Turiák amb l’Oficina Nacional de Recerca, Desenvolupament i Innovació, i la beca de recerca János Bolyai de l’Acadèmia Hongaresa de Ciències. La supervisió anà a càrrec d’Inguglia, Chiaramonte, Arizza i Di Stefano. L’article fou redactat originàriament per Inguglia i Chiaramonte. Chiaramonte trameté l’article a PLoS el 4 de setembre del 2019. L’edició fou a càrrec de Sebastian D. Fugmann, de la Universitat Chang Gung. Acceptat el 24 de gener del 2020, l’article fou publicat el 19 de febrer.
Quan Inguglia et al. fan referència a la complexitat del sistema immunitari de les garotes es refereixen concretament al caràcter heterogeni de les cèl·lules immunes en termes morfològics i funcionals. En Paracentrotus lividus s’han descrit quatre subpoblacions de cèl·lules immunes: els fagòcits, les cèl·lules vibràtils, les cèl·lules esfèrules incolores i les cèl·lules esfèrules vermelles. En els llibres clàssics, totes les cèl·lules que circulen per la cavitat corporal (el fluid celòmic) reben el nom genèric de celomòcits, i sota aquest nom es registren els diferents processos immunitaris: fagocitosi, encapsulació de cossos estranys, producció de molècules antimicrobianes.
Però com s’ho fan les cèl·lules immunitàries de la garota per no atacar les pròpies estructures de l’organisme? Ho fan condicionant la resposta immune al reconeixement específic de patrons moleculars associats a patògens (PAMPs en l’acrònim anglès). Aquest reconeixement és mediat per receptors específics (PRRs). Els PRRs no tan sols es troben en les pròpies cel·lules immunitàries, sinó que també circulen pel fluid celòmic de manera soluble. En vertebrats també existeixen PRRs, però no són tan variats com ho són en els equinoderms.
Els PRRs d’equinoderms reconeixen PAMPs associats a la paret cel·lular bacteriana: el lipopolisacàrid (LPS), els peptidoglicans (PGN), els lipopèptids, la flagel·lina. Però reconeixen també PAMPs associats a altres components microbians (flagel·lina, ADN, ARN bicatenari, etc.). Quan s’activa un PRR, entren en funcionament sistemes de complement i activadors que condueixen la resposta immune, i que també ells mateixos presenten una notable diversitat. Altres components moleculars del sistema immune (lectines, proteïnes antimicrobianes, receptors de tipus Toll, proteïnes de senyalització, etc.) també afegeixen diversitat i efectivitat.
En aquesta recerca, Inguglia et al. fan una investigació proteòmica dels celomòcits durant la resposta a una injecció de LPS en la cavitat corporal. En analitzar simultàniament totes les proteïnes cel·lulars poden superar la limitació de coneixements existents sobre els mecanismes moleculars implicats en la resposta del celomòcit a l’endotoxina bacteriana.
Els experiments es feren sobre una mostra de 40 garotes adultes recollides en aigües davant del litoral de Palerm. Els exemplars foren recollits a fondàries de 5-10 metres, prop d’una prada de posidònies (Posidonia oceànica). Els animals eren mantinguts en un aquari airejat amb aigua de mar reconstituïda i filtrada, a una temperatura de 12-15°C i a un cicle de 10 hores de llum i 14 de foscor. Cada setmana es feia una renovació parcial de l’aigua, i se’ls alimentava amb una barreja comercial d’invertebrats. En aquestes condicions eren mantingudes un mínim de 4 setmanes com a període d’aclimatació.
Les injeccions a la cavitat celòmica es feien a través de la membrana peristomial. Les injeccions amb LPS consistien en 2 µg de LPS comercial d’Escherichia coli per mL de fluid celòmic. Els 2 µg eren resuspesos prèviament en fluid celòmic artificial (10 mM CaCl2; 14 mM KCl; 50 mM MgCl2; 398 mM NaCl; 1.7 mM Na2HCO3; 25 mM Na2SO4). Els individus control eren els que rebien una injecció de 100 µL d’aquest fluid celòmic artificial.
Les mostres de fluid celòmic (4 mL) eren extretes amb una xeringa precarregada amb solució isomòtica anticoagulant. Es prengueren mostres a diferents temps després del tractament: 1 h, 3 h, 6 h i 24 h.
Per cada punt temporal, s’obtingué un pool de celomòcits procedents de cinc animals diferents, fins a arribar a un total de 10 milions de cèl·lules, que eren resuspeses en 1 mL. Les cèl·lules eren després lisades per fer un extracte total de proteïnes. Els extractes de proteïnes, després d’ésser quantificats per fluorimetria, eren congelats a -80°C.
Els extractes proteics foren analitzats en un sistema d’espectrometria de masses (Q-TOF). Prèviament, els extractes havien estat tripsinitzats. Els pèptids resultants, doncs, són separats en funció del seu pes molecular. D’això se’n deriven seqüències peptídiques i, en termes generals, tot un patró proteòmic de la mostra.
L’anàlisi bioinformàtica (programa Panther) permet identificar proteïnes a través d’aquests patrons peptídics. També es poden identificar les interaccions proteïna-proteïna (programa STRING) i les vies de senyalització a les quals pertanyen (KEGG).
Els canvis proteòmics induïts per la injecció de LPS
A través del programa MaxQuant, amb una taxa de l’1% de falsa descoberta, Inguglia et al. reconeixen en les seves mostres un total de 146 proteïnes per dos o més pèptids únics. Poden estimar l’abundància relativa d’aquestes 146 proteïnes en la comparació control vs. tractament, i en els diferents temps de tractament.
A través del programa Panther, reconegueren un total de 137 proteïnes, que es poden dividir en 18 classes diferents: 1) proteïnes d’unió a calci; 2) molècules d’adhesió cel·lular; 3) xaperones; 4) proteïnes citoesquelètiques; 5) moduladors enzimàtics; 6) hidrolases; 7) isomerases; 8) ligades; 9) liases; 10) proteïnes de tràfic de membrana; 11) proteïnes d’unió a àcids nucleics; 12) oxidoreductases; 13) receptors; 14) molècules de senyalització; 15) factors de transcripció; 16) proteïnes de transferència o portadores; 17) transferases; 18) transportadors.
Les classes més abundants (>10%) entre aquestes 137 proteïnes eren les de citoesquelet, els moduladors enzimàtiques (petites GTPases, proteïnes G heterotrimèriques, inhibidors de proteases), hidrolases i factors d’unió a àcids nucleics. En aquestes quatre classes s’encabeixen el 55,8% de les proteïnes analitzades.
Entre les proteïnes citoesquelètiques analitzades, la majoria (69,2%) són de la família de l’actina, seguides per la família dels microtúbuls (30,8%).
Entre les proteïnes de modulació enzimàtica analitzades, la majoria (72,2%) són proteïnes G, seguides de moduladors de proteïnes G (11,1%). Aquestes proteïnes són a la base de les vies de senyalització que participen en la funció immunitària. També dins de la categoria de proteïnes moduladores entren els inhibidors de proteases (16,7% de les proteïnes analitzades).
Entre les hidrolases analitzades, n’hi ha un 88,9% de proteases i un 11,1% de desaminases.
Entre les proteïnes d’unió a àcids nucleics analitzades, n’hi ha un 53,3% que s’uneixen a ADN i un 46,7% que s’uneixen a ARN.
Per a les anàlisis bioinformàtiques ulteriors, Inguglia et al. es fixen en les 88 proteïnes més abundants. Els canvis quantitatius més pronunciats es registren a les 3 hores després de la injecció de LPS.
En el cas de la proteïna HSP70, hom verificà les dades proteòmiques amb una tècnica de western blot. En el cas de la β-timosina es va recórrer a una tècnica de dot-blot.
La interacció física i funcional de les proteïnes alterades
Una hora després de la injecció de LPS és possible distingir quatre agrupacions de les proteïnes modulades: 1) factors del citoesquelet; 2) membres de la superfamília RAS de GTPases; 3) proteïnes de xoc tèrmic; 4) histones.
Diagrama de les interaccions entre les proteïnes activades 3 hores després de la injecció de LPS. Hom hi detecta dos agrupacions principals: en verd apareixen proteïnes implicades en el citoesquelet i en la senyalització RAS i en vermell apareixen proteïnes implicades en l’homeostasi energètica
A les sis hores de tractament, s’observen dues agrupacions de proteïnes modulades: 1) proteïnes relacionades amb l’organització del citoesquelet i GTPases RAS; 2) proteïnes RAB implicades en el transport, fusió i reciclatge de vesícules i endosomes.
A les 24 hores de tractament, les proteïnes modulades es redueixen a una sola agrupació, formada per proteïnes relacionades amb el citoesquelet.
Els processos cel·lulars modulats per la injecció de LPS
En les primeres hores (1, 3 i 6) posteriors a la injecció de LPS, s’hi detecta una modulació de proteïnes implicades en l’endocitosi i el fagosoma. A les 24 hores després de la injecció, tan sols es manté la via de la fagocitosi.
La base proteòmica del sistema immunitari innat de la garota
Una hora després de la injecció de LPS, ja es registren canvis proteòmics en els celomòcits. Concretament, hi ha un augment de factors citoesquelètics (actines, β-tubulines, calmodulina) implicats en la contractilitat cel·lular. La dinàmica del citoesquelet seria regulada per proteïnes de la família de CDC42 i Ras, que promouen la formació de protrusions (lamel·lipodis i fil·lopodis) de la membrana plasmàtica, gràcies a la polimerització d’actines en la perifèria cel·lular.
Paral·lelament, també hi ha una modulació de proteïnes RAB, que promouen el tràfic d’endomembranes.
Les alteracions del citoesquelet i de les endomembranes sostenen els processos d’endocitosi i de fagocitosi dels celomòcits. El procés de fagocitosi continua activat 24 hores després de la injecció de LPS, mentre que llavors ja hauria cessat l’activació de l’endocitosi.
La injecció de LPS també promou en els celomòcits la modulació de proteïnes histones. Les histones participen en la regulació de la cromatina (el material genètic del nucli cel·lular).
A les 3 hores de la injecció de LPS es produeix el pic de modulació proteòmica. Entre les proteïnes modulades hi ha les implicades en l’homeostasi energètica (glucosa-6-fosfat isomerasa, piruvat-cinasa, malat-deshidrogenasa, enolasa). Inguglia et al. ho interpreten en el marc dels requeriments energètics de la fagocitosi (polimerització d’actina, maduració de vacuoles, acidificació, producció de proteïnes antimicrobianes).
Inguglia et al. qualifiquen el seu estudi de pilot. De fet, tenen programats experiments ulteriors per distingir entre les diferents subpoblacions de celomòcits, així com utilitzar diferents components bacterians. El desenvolupament dels projectes de genòmica d’equinoderms també ajudaran a treure més profit de les anàlisis transcriptòmiques i proteòmiques.
Lligams:
– Changes in the proteome of sea urchin Paracentrotus lividus coelomocytes in response to LPS injection into the body cavity. Luigi Inguglia, Marco Chiaramonte, Vincenzo Arizza, Lilla Turiák, Károly Vékey, Laszlo Drahos, Rosa Pitonzo, Giuseppe Avellone, Vita Di Stefano. PLoS One 15: e0228893 (2020).
– Changes in the proteome of mediterranean sea urchin Paracentrotus lividus due to activation of its immune system. PXD008439.
Des de la Mediterrània 