Les febres de Malta, també conegudes com a febre ondulant o febre mediterrànies, són causades per bacteris del gènere Brucella, i d’ací que també rebin el nom de brucel·losi. És una malaltia que a casa nostra associem al consum de llet crua, però el cas és que la brucel·losi és una de les malalties zoonòtiques de major incidència global, i apareix en la llista de patologies negligides pel poc esforç que s’hi fa en recerca en relació amb el seu impacte en termes de salut pública i en costos per a la ramaderia. El professor Gamal Wareth Abdelaziz Mohamed, de la Universitat Benha, investiga patògens de nivell 3 com Francisella tularensis, Burkholderia mallei, Bacillus anthracis, Yersinia pestis o la pròpia Brucella. Aquesta setmana apareix com l’autor corresponsal d’un article publicat a la revista Transboundary and Emerging Diseases que fa un retrat de la distribució, diversitat genètica i llinatges de Brucella melitensis en humans i animals a Egipte. La primera autora de l’article és Katharina Holzer, de la Universitat de Hohenheim. Holzer et al. han partit de 136 soques de B. melitensis aïllades de mostres animals i humanes d’Egipte entre els anys 2001 i 2020. Les han analitzades pel que fa als polimorfismes mononucleotídics (cgSNP) dels genomes respectius i al nombre variable de setze repeticions en tàndem (MLVA-16). Han trobat que gairebé totes les soques estudiades pertanyen al clade Mediterrani Occidental. Les úniques excepcions són una soca aïllada en búfal que pertany al clade Americà i una soca aïllada en camell que pertany al clade Mediterrani Oriental. Holzer et al. troben una correlació significativa entre els casos humans de brucel·losi i possibles fonts infeccioses en animals. Les soques relacionades amb brots epidèmics persisteixen al llarg dels anys i es difonen a llarga distància entre els governorats d’Egipte. Si les dades de MLVA-16 per si soles són poc informatives, en combinar-les amb el cgSNP ajuden a fer-se una figura de conjunt: Holzer et al. descriuen en aquest estudi 99 genotips diferents de cgSNP. La comparació amb bases de dades internacionals els permet d’assenyalar esdeveniments d’introducció de noves soques de B. melitensis a Egipte a través de la importació de bestiar.
<
Imatge microscòpica de bacteris de l’espècie ‘Brucella melitensis’, que Alice Catherine Evans (1881-1975) identificà en el 1917 com l’agent causal de les febres de Malta
La brucel·losi a Egipte
Aquesta recerca fou concebuda per Wolfgang Beyer i Katharina Holzer, de l’Institut de Ciència Animal del Departament d’Infectologia de Bestiar i Higiene Ambiental de la Universitat de Hohenheim, amb seu a Stuttgart. Aportaren recursos Mohamed El-Diasty (de l’Institut de Recerca en Salut Animal del Centre de Recerca Agrícola del Cairo), Gamal Wareth (de l’Institut Friedrich Loeffler d’Infeccions Bacterianes i Zoonosis, amb seu a Jena, i del Departament de Bacteriologia, Immunologia i Micologia de la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat Benha, de Moshtohor), Shawky A. Moustafa (Benha), Nour H. Abdel-Hamid (Cairo), Mahmoud E. R. Hamdy (Cairo), Ashraf E. Sayour (Cairo), Mohamed Elhadidy (del Programa de Ciències Biomèdiques de la Universitat de Ciència i Tecnologia, de Giza, i del Departament de Bacteriologia, Micologia i Immunologia de la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat de Mansoura) i Essam M. Elbauomy (Cairo). La metodologia fou dissenyada per Beyer, Holzer i Jörg Linde (Jena). El programari fou a càrrec de Holzer, Linde, Felix Bartusch (del Grup de Computació de la Universitat de Tübingen) i Mostafa Y. Abdel-Glil (Jena). Beyer, Holzer i Linde feren la validació. En la investigació participà Holzer. El tractament de dades fou realitzat per Beyer, Holzer, Linde, Bartusch, Abdel-Glil, Wareth, El-Diasty, Abdel-Hamid, Hamdy, Moustafa, Sayour i Elbauomy. L’esborrany inicial de l’article fou preparat per Holzer i Beyer, amb participació posterior de Wareth, Linde, Falk Melzer (Jena), Bartusch, Abdel-Glil, Sayour, Elhadidy i Abdel-Hamid. El projecte fou administrat per Beyer. Els fons foren aconseguits per Beyer i Elhadidy, a través de LEAP-AGRI, la Fundació Alemanya de Recerca i el CRDF.
Dins del gènere Brucella s’inclouen 12 nomo-espècies. Les més rellevants en els casos humans de brucel·losi són B. melitensis, B. abortus i B. suis. Les més virulentes són B. melitensis i la majoria de biovars de B. suis, mentre que B. abortus i B. suis biovar 2 són més benignes. El reservori més important per a B. melitensis són els petits remugants (ovins i caprins), mentre que el reservori més important per a B. abortus és el bestiar boví. L’agent més freqüent de brucel·losi humana és B. melitensis. La brucel·losi humana s’adquireix principalment per contacte directe amb animals infectats, o pel consum de llet o derivats no-pasteuritzats. No obstant, també és possible la transmissió a través d’aerosols, i d’ací l’especulació sobre l’ús de Brucella com a agent bioterrorista.
En el control de la brucel·losi és vital disposar d’un programa de vigilància que empri mètodes selectius capaços de rastrejar l’origen dels casos animals i humans. La incidència de brucel·losi a Egipte ha anat en augment des dels anys 1960, en paral·lel a la importació de vaques frisones. Malgrat el programa d’eradicació de la brucel·losi, iniciat en el 1981, la infecció ha esdevingut endèmica a Egipte, degut a les escasses mesures de bioseguretat en granges, l’elevada densitat de bestiar, l’alta densitat demogràfica, els hàbits alimentaris tradicionals, els moviments incontrolats de bestiar, etc.
Holzer et al. han emprat en aquest estudi un total de 136 aïllats de B. melitensis procedents d’Egipte. Entre aquests aïllats n’hi ha dels anys 2001 i del 2002, dels brots del 2006 i del 2007, i d’altres del període 2010-2020. Es realitzà una seqüenciació de tot el genoma d’aquests aïllats, a partir de la qual es va fer una anàlisi de polimorfismes mononucleotídics (SNP) i una deducció in silico de les dades de 16 marcadors de repeticions en tàndem (MLVA-16).
Els 136 aïllats procedeixen de diversos governorats. N’hi ha 13 obtinguts de mostres de sang de pacients humans amb brucel·losi. N’hi ha 123 procedents d’animals, entre els quals 22 de búfals, 2 de camells, 66 de vaques, 13 de cabres i 20 d’ovelles. El protocol de l’estudi fou aprovat pel comitè ètic de l’Institut de Recerca en Salut Animal de Giza. En les mostres de pacients humans es recollí el consentiment informat, i foren protegides les dades personals corresponents.
De l’hisop a la base de dades
Les mostres recollides amb hisops eren escampades en cultius líquids d’agar selectiu per a Brucella. Després de cinc dies s’examinava el creixement bacterià. Els aïllats eren obtinguts després de tres subcultius successius. En el cas de 48 aïllats, l’extracció d’ADN es realitzà directament després del cultiu, mentre que en el cas 89 aïllats es realitzà una inactivació per calor prèvia.
Els extractes d’ADN foren tramesos a Eurofins Genomics GmbH, que preparà la corresponent genoteca i emprengué la seqüenciació d’ADN genòmic total. Els arxius genòmics en format fastq són accessibles a la base de dades del NCBI sobre el projecte PRJNA773199.
Amb el programa Geneious v.11.15 es determinà in silico l’espècie a la qual pertanyien els isolats. Igualment in silico es realitzà l’anàlisi de SNP amb Snippy tenint en compte el genoma central (és a dir, excloent-hi els gens d’ARN ribosòmic i altres elements “perifèrics”). Com a genoma de referència s’utilitzava B. melitensis 16M. Els genotips cgSNPGTs eren definits utilitzant un màxim d’una diferència en cgSNP.
A partir de les dades de cgSNP i d’identificació específica, es realitzà una anàlisi filogenètica i es determinà l’índex de diversitat de Simpson (SDI). Els clades definits de B. melitensis són l’Africà, l’Americà i el Mediterrani Oriental. Holzer et al. han definit per a aquest estudi un quart clade, el Mediterrani Occidental.
El genotipat per repeticions en tàndem (MLVA-16) també es va fer in silico, en aquest cas amb MISTReSS.
Els resultats dels 136 aïllats d’aquest estudi foren comparats amb les seqüències ja publicades a NCBI. A GenBank trobaren 216 entrades d’origen conegut. En total, empraren dades de 710 aïllats.
Aïllats procedents de 17 governorats d’Egipte
Els aïllats utilitzats en aquest estudi es corresponen a 17 dels 27 governorats d’Egipte, principalment del nord d’Egipte. El període cobert és de més de 20 anys, si bé concentrat en el període 2010-2020.
Un total de 136 aïllats relacionats amb brots de brucel·losi foren assignats a B. melitensis.. La immensa majoria es corresponen al clade Mediterrani Occidental, amb tan sols dues excepcions:
– l’aïllat 15707, obtingut d’un búfal d’Ismailia el 2017 pertany al clade Americà. Difereix en 2914 cgSNPs de l’aïllat més proper.
– l’aïllat HEA143, obtingut d’un camell del Mar Roig el 2016 pertany al clade Mediterrani Oriental. Difereix en 3087 cgSNPs de l’aïllat 21874 i en 2630 cgSNPs de l’aïllat 15707.
Els 135 aïllats de B. melitensis Mediterrani Occidental es divideixen en 97 cgSNPGTs, agrupables en 3 clústers i 15 subclústers. L’índex de diversitat de Simpson és de 0,9921.
Entre els subclústers trobem:
– SC1a: inclou 17 aïllats d’animals, corresponents al període del 2011-2019 i de diferents governorats, com ara el Faiyum (HEA151 i HEA152), Sharqia (HEA70), Assiut (5319).
– SC1b: inclou 11 aïllats molt homogenis, procedents de quatre governorats (Kafr El Sheik, Faiyum, Gharbia i Ismailia), els més antics dels quals són del 2013 (HEA6 i HEA58).
– SC1c es pot dividir en dos grups, tots ells del 2019.
– SC2a és un grup homogeni de 3 aïllats humans i 2 animals.
– SC2b inclou un aïllat humà.
– SC2c és divers. No obstant HEA43, del 2006, i 5317, del 2014, pertanyen a un mateix llinatge.
– SC2d conté cinc aïllats de quatre localitats diferents, i d’un període que va del 2006 al 2014.
– SC3a conté quatre aïllats del 2015-2016 i tres del 2020.
– SC3b conté aïllats molt homogenis, tots ells de Monufia, i dels anys 2018-2019.
– SC3c conté 5 aïllats del 2018 i del 2019.
– SC3d conté dos aïllats, un de Giza (2012) i un altre de Matruh (2015).
– SC3e conté 17 aïllats de Monufia, 1 de Sharqia i 1 d’Ismailia, tots ells del 2018-2019.
– SC3f conté 5 aïllats del Cairo, Ismailia i Kafr El Sheik, del període 2015-2017.
– SC3g conté un grup homogeni de 12 aïllats del 2017 de 4 governorats (Gharbia, Ismailia, Monufia i Beni Suef).
– SC3h conté 3 aïllats de Matruh del 2015.
D’acord amb les dades de MLVA-16, es defineixen 64 MLVAGTs. 15707 (clade Americà) i HEA143 (clade Mediterrani Oriental) queden ben diferenciats. Quatre dels 64 MLVAGTs són idèntics a entrades de les bases de dades de França i de Sicília. Els altres 60 MLVAGTs no són presents en les bases de dades.
Les comparacions amb les bases de dades indiquen que els parents més estrets dels aïllats egipcis són aïllats italians també assignats al clade Mediterrani Occidental.
Implicacions de l’estudi en el control de la brucel·losi a Egipte
B. melitensis sembla ben escampat en el nord d’Egipte. Dels aïllats inclosos en aquest estudi tan sols un grapat provenen d’Assiut, Aswan o Shalateen.
Entre les soques de B. melitensis que produeixen brots de brucel·losi a Egipte n’hi ha que s’han difós en un període llarg (p. ex. SC2d, present en quatre governorats entre el 2006 i el 2014). El subclúster SC2a podria haver-se originat a Giza en el 2011 per després escampar-se a Beni Suef i Dakahlia. El subclúster SC2b hauria estat actiu durant un període mínim de 13 anys, a comptar des del 2007.
D’altres soques semblen ésser el resultats d’introduccions recents: SC1a, SC2c i SC3a haurien arribat a Egipte en el 2020.
Aquesta metodologia pot ajudar a definir les soques a mesura que apareguin. Holzer et al. estimen que una divergència inferior a 10 cgSNPs és indicativa d’una continuïtat de soca. L’estudi també posa de manifest la connexió entre els brots humans i els brots animals.
Lligams:
– Tracking the distribution, genetic diversity, and lineage of Brucella melitensis recovered from humans and animals in Egypt based on core-genome SNP analysis and in silico MLVA-16. Katharina Holzer, Gamal Wareth, Mohamed El-Diasty, Nour H. Abdel-Hamid, Mahmoud E. R. Hamdy, Shawky A. Moustafa, Jörg Linde, Felix Bartusch, Mostafa Y. Abdel-Glil, Ashraf E. Sayour, Essam M. Elbauomy, Mohamed Elhadidy, Falk Melzer, Wolfgang Beyer. Transbound. Emerg. Dis. (2022).
Des de la Mediterrània 